Кирица Е. Направленный синтез каротиноидов у дрожжей и перспектива их использования

Подождите немного. Документ загружается.

Таким образом, в ходе проведенных исследований было установлено, что

наиболее активный рост биомассы дрожжей происходил при культивировании на

питательной среде MZ-30, в состав которой входил ацетат натрия (3,0 г/л).

Выращивание штамма дрожжей Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03 на данной среде

позволяет увеличить прирост биомассы на 95%, что составляет 14,38 г/л.

Каротинообразование дрожжей, как показали исследования, происходит наиболее

эффективно в присутствии лимонной кислоты концентрацией 1,0 г/л. Наличие

предшественника в составе среды для выращивания дрожжей способствует

увеличению выхода каротиноидных пигментов на 79,58%, что составляет 151,85 % на

1 литр питательной среды по сравнению с контролем.

4.3 Влияние индукторов на продуктивность и биосинтез

каротиноидов дрожжами Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03

В настоящее время для получения каротиноидов микробиологическим путем в

заводской практике используются различные стимуляторы: β-ионон и его более

дешевые заменители (1,6,6-триметил-1-ацетилциклогексен, лимонен, цитрусовая

пульпа или цитрусовое масло, ретинол, некоторые ароматические соединения

(диметилфталаты, вератрол) и ряд гетероциклических соединений (изониазид,

ипрониазид)) (ФЕОФИЛОВА, 1996).

Согласно данным литературы, индукторы синтеза каротиноидов делятся на 3

группы: триспоровые кислоты; соединения, содержащие β-иононовое кольцо, и

фенилпроизводные, из которых в практике используют диметилфталат и вератрол

(CERDA-OLMEDO, 1989). Исходя из того, что механизм действия этих соединений

неизвестен, но существенные различия в их химическом строении и в то же время

одинаковая способность усиливать синтез каротиноидов, позволяют предположить, что

синтез каротиноидов интенсифицируется при действии неблагоприятных факторов

среды (BONSISSDA, 1991). Так, на средах, содержащих кукурузную и соевую муку,

подсолнечное масло и β-ионон, можно увеличить выход β-каротина до 3 г/л среды

(ФЕОФИЛОВА, 1995). Недостатком производства является дороговизна среды

выращивания. В связи с этим, перспективным является возможность удешевления

среды выращивания путем использования в качестве индукторов растительных масел

(ЕГОРОВ, 1989; ВАСИЛЬЧЕНКО и др., 1992; QIU HONG-DUON et.a l., 2001).

Исходя из этого, целью наших исследований являлось изучение влияния

кукурузного, подсолнечного, соевого, оливкового масел и ретинола на

биосинтетическую активность дрожжей Rhodotorula gracilis CNMN-YS – 03 и

выявление специфических индукторов процесса каротинообразования.

Таблица 4.3

Влияние индукторов на продуктивность и содержание каротиноидов у дрожжей

Rhodotorula gracilis – CNMN-YS – 03

Проведенные исследования показали, что внесение в среду культивирования

дрожжей растительных масел оказывает положительное влияние на рост биомассы

(табл. 4.3). Увеличение выхода биомассы дрожжей составляет 31,54-65,15 % по

сравнению с контролем. Согласно полученным результатам, повышение

Продуктивность

Содержание каротиноидов

Варианты

питательных

сред

г/л с.в.

Х1±Х2

% К

мкг/г с.в.

Х1±Х2

% К

мкг/л

Х1±Х2

% К

Лундина + 1,0

г/л

подсолнечного

масла

5,23±0,09 165,15 498,27±3,772 100,94 2605,95±95,519 166,53

Лундина + 1,0

г/л соевого

масла

4,15±0,05 131,54 533,28±0,243 108,03 2213,14±3,821 141,43

Лундина + 1,0

г/л

оливкового

масла

4,22±0,06 133,12 572,70±3,215 116,02 2412,58±30,541 154,17

Лундина + 1,0

г/л

кукурузного

масла

4,81±0,05 151,73 661,21±12,343 133,95 3180,41 ±95,461 203,24

Лундина + 1,0

г/л ретинола

2,99±0,03 94,32 573,81±4,070 116,24 1715,69 ±21,589 109,64

Лундина (К)

3,17±0,05 100,00 493,64 ±2,591 100,00 1564,85 ±36,408 100,00

продуктивности на 62,15 и 31,54 % наблюдается при культивировании дрожжей на

вариантах сред, в состав которых входят подсолнечное или кукурузное масло

концентрацией 1,0 г/л. Эффективность использования подсолнечного масла можно

объяснить присутствием в его составе таких жирных кислот, как линолевая (~55%) и

олеиновая (~40%), пальматиновая (~3%), стеариновая (~2%), которые, согласно

литературным данным, являются активаторами синтеза ряда ферментов

(РАЗУМОВСКИЙ и др.; ФЕОФИЛОВА, 1989).

Изучение действия индукторов на процесс каротиногенеза дрожжей Rhodotorula

gracilis CNMN-YS–03, показало, что суммарное содержание каротиноидов в биомассе

дрожжей варьирует в зависимости от вида индуктора, вносимого в питательную среду

(табл. 4.3).

Результаты, представленные в таблице, свидетельствуют о том, что растительные

масла и ретинол, используемые в питательной среде концентрацией 1,0 г/л в качестве

индукторов, оказывают позитивное влияние на процесс каротинообразования дрожжей.

Отметим, что каротинообразование дрожжей Rhodotorula gracilis – CNMN-YS –

03, выращенных на синтетической питательной среде Лундина стимулировалось в

значительной степени при использовании кукурузного масла концентрацией 1,0 г/л.

Количество каротиноидов при этом составило 661,21 мкг/г сухих веществ, что на

33,95% больше контрольного значения. Присутствие в составе среды оливкового масла

и ретинола оказывало сходное влияние на содержание каротиноидов в клетке,

количество которых увеличивалось на 16% по сравнению с контролем. Анализируя

данные, представленные в таблице 4.3 можно заключить, что максимальное количество

пигментов в биомассе достигает 2561,12 и 3180,41 мкг/л в случае добавления к

ферментационной среде подсолнечного и кукурузного масла концентрацией 1,0 г/л, что

превышает

контрольные значения на 63,67 % и 103,24 %, соответственно.

Стимулирующее действие кукурузного масла обуславливается, вероятно,

присутствием в его составе ~ 80% ненасыщенных жирных кислот (линолевой,

линоленовой, арахидоновой), которые придают клеточным мембранам необходимую

текучесть, служат предшественниками других компонентов клетки и являются

активаторами синтеза ряда ферментов (NIPPON, 1992; www.Uro.Web.ru).

Результаты исследования изменения качественного состава каротиноидного

комплекса дрожжей Rhodotorula gracilis CNMN-YS–03 в присутствии индукторов

представлены на рисунке 4.3.

102

104

115

146

111

050100150

% К

101

112

118

113

101

90 100 110 120

% К

а) б)

110

116

139

149

0 50 100 150

% К

в)

1 - Лундина + 1,0 г/л подсолнечного масла; 2 – Лундина + 1,0 г/л соевого масла;

3 – Лундина + 1,0 г/л оливкового масла; 4 – Лундина + 1,0 г/л кукурузного масла;

5 – Лундина + 1,0 г/л ретинола

Рисунок 4.3. Влияние индукторов каротиногенеза на содержание β - каротина (а),

торулина (б) и торулародина (в) в биомассе дрожжей Rhodotorula

gracilis CNMN-YS – 03

Полученные результаты исследований позволили констатировать, что биосинтез

главного пигмента дрожжей - β- каротина происходит наиболее активно при наличии в

питательной среде кукурузного масла, обладающего способностью увеличивать его

содержание в 1 г сухой биомассы дрожжей

до 329,310 мкг/г с.в., что на 46 % больше

по сравнению с контролем (рис. 4.3 (а)). Наличие в среде культивирования оливкового

масла и ретинола также способствовало увеличению биосинтеза данного пигмента, но

только в меньшей степени - на 15 и 11 %, соответственно по отношению к контролю.

Анализ результатов изучения изменения содержания торулина - представителя

красной группы пигментов, при культивировании дрожжей на синтетической среде,

содержащей индукторы, показал, что биосинтез пигмента варьирует в зависимости от

вида индуктора, входящего в состав среды (рис. 4.3 (б)). Так, наилучшие результаты

были получены при использовании в качестве индуктора процесса

каротинообразования оливкового масла концентрацией 1,0 г/л. Присутствие его в

среде способствовало увеличению выхода торулина до 185,19 мкг/г (на 18%).

Торулародин, как следует из результатов, представленных на рисунке 4.3 (в),

образуется в большей степени при наличии в составе ферментационной среды

Лундина ретинола концентрацией 1,0 г/л. Культивирование на среде такого состава

способствовало увеличению содержания данного пигмента на 49 %, что составляет

164,56 мкг/г с.в.

Обобщая результаты исследований влияния растительных масел и ретинола на

активность роста и процесс каротинообразования дрожжей, отметим, что подсолнечное

и кукурузное масла представляют особый практический интерес, так как присутствие

их в среде культивирования позволяет увеличить одновременно выход биомассы и

количество каротиноидных пигментов, синтезируемых дрожжами.

Полученные результаты согласуются с данными литературы о стимулирующем

действии растительных масел на биосинтетическую активность дрожжей

(АТАМАНЮК, 1971; РАЗУМОВСКИЙ и др., 1975; ФЕОФИЛОВА, 1994).

В связи с тем, что лучшие результаты по использованию индукторов в питательной

среде для культивирования дрожжей Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03 были получены

при добавлении кукурузного и подсолнечного масел, следующим этапом наших

исследований было определение оптимальной концентрации индуктора, вносимого в

ферментационную среду, при которой биосинтетическая активность дрожжей

достигает максимума.

Исследования по влиянию подсолнечного и кукурузного масел показали, что

способность дрожжей аккумулировать клеточную массу дрожжей и

синтезировать

каротиноидные пигменты, варьирует от концентрации используемого вида индуктора

(рис. 4.4).

Рисунок 4.4. Влияние растительных масел на продуктивность и биосинтез

каротиноидных пигментов дрожжами Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03

Анализ результатов исследований позволил констатировать, что аккумуляция

клеточной массы дрожжей происходит более активно при культивировании штамма

дрожжей Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03 на питательной среде, в состав которой

входит подсолнечное масло концентрацией 1,0 г/л. Продуктивность биомассы при этом

возрастает на 62 %, по сравнению с контрольным образцом. Кроме того, процесс

каротинообразования активизируется в значительной степени при выращивании

дрожжей на питательной среде, содержащей кукурузное масло концентрацией 1,0 г/л.

Культивирование штамма на среде данного состава позволяет увеличить содержание

каротиноидов в биомассе на 61% по сравнению с контролем.

Также было установлено, что биосинтез β-каротина происходил активно при

внесении в питательную среду двух видов масел (подсолнечного или кукурузного),

концентрацией 1,0 г/л, присутствие которых позволило увеличить содержание данного

пигмента в биомассе дрожжей на 70-72 % по отношению к контролю (рис. 4.4).

Биосинтез торулина - представителя каротиноидов красной группы пигментов,

согласно представленным результатам, происходит наиболее активно при

выращивании дрожжей в присутствии подсолнечного масла концентрацией 1,0 г/л.

Количество торулина в данном случае возрастает на 40 % по сравнению с контролем.

134

120

162

152

121

124

109

122

120

161

116

136

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

% К

0,5

подсолнечное кукурузное

растительные масла

Биомасса Каротиноды

131

114

170

140

108

122

118

121

112

114

134

172

133

161

143

116

133

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

% К

0,5 г/л

1 г/л

2 г/л

0,5 г/л

1 г/л

2 г/л

подсолнечное кукурузное

растительные масла

β-каротин торулин торулародин

Рисунок 4.5. Влияние различных концентраций растительных масел на

качественный состав каротиноидов дрожжей Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03

Биосинтез торулародина происходит наиболее эффективно при культивировании

штамма дрожжей Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03 на питательной среде с

добавлением кукурузного масла концентрацией 1,0 г/л, в состав которого входят

ненасыщенные жирные кислоты (линолевая, линоленовая), основной функцией

которых является участие в качестве предшественников в синтезе «гормонов местного

действия» (рис.4.5) (МЕЦЛЕР, 1986; QIU HONG-DUON et.al., 2001).

Обобщая полученные результаты можно констатировать, что присутствие

растительных масел в среде культивирования дрожжей Rhodotorula gracilis CNMN-YS-

03 оказывает положительное влияние с различным уровнем эффективности действия на

каротинообразование дрожжей, что объясняется их химическим составом.

Таким образом, проведенные исследования показали, что наиболее активным

индуктором процесса пигментообразования дрожжей является кукурузное масло.

4.4. Влияние координационных соединений Fe (II) на биосинтез

каротиноидов дрожжами рода Rhodotorula

Перспективным направлением в современной биотехнологии является изучение

возможности использования координационных соединений металлов для

направленного культивирования микроорганизмов (РУДИК, 1990; 1993; CHIRIAC et

al., 2004; RUDIC et al., 2004). По своей природе металлокомплексы близки к

биологическим соединениям, ответственным за жизнеспособность микроорганизмов.

Известно, что потребность клеток в ионах металлов в значительной степени зависит от

обеспеченности кислородом. Поскольку промышленное культивирование

микроорганизмов проводится, как правило, при низких концентрациях растворенного

кислорода, необходимо учитывать, что в этих условиях может возрастать потребность

клеток в ионах железа.

Трудность обеспечения клеток ионами железа заключается в том, что водные

растворы солей железа неустойчивы вследствие окисления и гидролиза (КОВАЛЕВ и

др., 1985; 1987). Известно, что микроорганизмы обладают уникальной способностью к

выделению в среду хелаторов с высоким сродством к ионам железа, так называемых,

сидерофоров, обеспечивающих транспорт железа через плазмалемму в цитоплазму

(BYERS, AREENEAXUS, 1977). Тем не менее, доказано, что содержание железа в

биомассе дрожжей S.cerevisiae составляло менее 1% от содержащегося в среде

двухвалентного железа (КОВАЛЕВ и др., 1985). Следовательно, при культивировании

микроорганизмов в промышленных условиях (при низких значениях рО

) необходимо

создание условий для обеспечения клеток достаточным количеством ионов железа

(низкие значения рН среды, использование хелаторов, повышенные концентрации

солей двухвалентного железа) (ДЕДЮХИНА, 1992).

Из выше сказанного следует, что ионы железа могут служить тем фактором,

который оказывает влияние на рост, биосинтез каротиноидов и других биологически

активных веществ, синтезируемых микроорганизмами (RUDIC, CEPOI, 1995).

Согласно литературным данным - никель является необходимым и очень

важным микроэлементом для роста и развития высших растений, участвуя в процессах

синтеза хлорофилла и каротиноидов (ЯГОДИН и др. 1991; RUDIC şi coaut. 1997;

ROTARU, 2001). Имеются сведения о влиянии никеля на активность окислительно-

восставновительных ферментов. В работах некоторых исследователей встречаются

отмечено, что никель является стабилизирующим фактором антоциановых пигментов,

действие которого связано с резким активированием аскорбинат– и олоксидаз.

Отмечается большое значение комплексирования некоторых переходных металлов с

липидами для осуществления фотосинтеза и эволюции этого процесса, в связи с

нахождением никеля в полярных липидах (Микроэлементы в жизни ..,1974;

ДЕДЮХИНА и др., 1992; RUDIC ş. a., 1999).

Марганец участвует в процессах синтеза различных компонентов живой клетки,

а также входит в состав таких ферментов, как супероксиддисмутаза

(митохондриальная), аргиназа, ацетил–КоА-карбоксилаза, гликозилтрансфераза,

участвующих в процессах жизнеобеспечения микроорганизмов (FABREGAS et. al.,

1988; NAGANUMA et. al., 1989).

Исходя из выше изложенного, актуальными представляются исследования

возможности использования некоторых координационных соединений железа в

качестве стимуляторов и регуляторов биосинтеза каротиноидных пигментов у

дрожжей.

Были исследованы координационные соединения Fe (II), которые были

синтезированы сотрудниками Института Химии АНМ под руководством академика

АНМ К. Турта:

 [Fe2Mn(CCl3COO)6(CH3OH)3] в концентрациях 0,1; 0,2;0,4; 0,8;1,6

мг/л

 [Fe2NiO(CCl3COO)6(CH3OH)3] в концентрациях 0,05; 0,1; 0,2; 0,5; и

1,0 мг/л

Объектами исследований служили штаммы дрожжей Rhodotorula gracilis –

CNMN-YS-III/5 и Rhodotorula gracilis – CNMN-YS- 03. В результате исследований было

установлено, что стимулирующий эффект зависит от химического состава вносимых

координационных соединений железа (табл. 4.4).

Таблица 4.4

Влияние координационных соединений Fe (II) на содержание каротиноидов в

биомассе дрожжей Rhodotorula gracilis CNMN-YS-III/5

Координационные соединения

Концентр

ация,

мг/л

Каротиноидны

е пигменты,

мкг/ г А.С.В.

М±м

% К Т

95%

0,1

290,23±8,1 98,15 2,097

0,2

298,15±10,2 100,83 2,246

0,4

309,39±52,0 104,63 5,445

0,8

328,81±46,81 111,19 6,898

[Fe2Mn(CCl3COO)6(CH3OH)3]

1,6

344,9±88,1 116,64 6,31

Контроль

295,7±42,36 100,00 2,78

0,05

200,9±8,1 97,43 0,49

0,1

216,8±3,3 105,14 1,38

0,2

313,4±10,2 151,98 7,65

[Fe2NiO(CCl3COO)6(CH3OH)3]

0,5

319,4±9,3 154,89 9,21

Контроль

206,2±6,9 100,00 2,78

Таким образом, добавление к среде Лундина для культивирования Rhodotorula

gracilis CNMN-YS-III/5 [Fe2Mn(CCl3COO)6(CH3OH)3] способствовало достоверному

увеличению выхода каротиноидов на 11,19%-16,64% по отношению к контролю (табл.

4.4). При культивировании дрожжей на питательной среде, в состав которой входило

соединение [Fe2NiO(CCl3COO)6(CH3OH)3] концентрацией 0,5 мг/л, увеличилось общее

количество каротиноидов в биомассе дрожжей на 54,89 % по отношению к контролю.

Результаты исследований, направленных на изучение изменений качественного

состава пигментов дрожжей, выращенных на питательных средах, в состав которых

входят координационные соединения железа, представлены на рисунке 4.6.

Анализ полученных результатов показал, что биосинтез отдельных пигментов (β-

каротина, торулина и торулародина) дрожжами Rhodotorula gracilis – CNMN-YS-III/5

зависит как от химической природы координационных соединений, так и от

концентрации их в питательной среде.

Следует отметить, что во всех вариантах опытов используемые соединения железа

играют роль биорегуляторов, которые оказывают стимулирующее действие на биосинтез

главного пигмента дрожжей - β-каротина. Установлено, что его содержание в биомассе

достигает максимума при внесении в состав питательной среды Лундина соединения

[Fe2NiO(CCl3COO)6(CH3OH)3] и составляет 167,6 мкг/ г с.в., что на 54% выше

контрольного содержания (рис. 4.6 (а)). Стимулирующий эффект двухвалентного железа,

вероятно, объясняется тем, что образование β- каротина происходит после нескольких

последовательных реакций дегидрирования, в результате которых образуются

сопряженные двойные связи, характерные для каротиноидов. В данных реакциях

дегидрирования железо является стимулятором (МЕЦЛЕР, 1986).

Анализируя данные, полученные после выращивания дрожжей на питательных

средах с координационными соединениями железа, установлено, что эффективным

стимулирующим агентом биосинтеза торулина является координационное соединение

[Fe2NiO(CCl3COO)6(CH3OH)3]. Эффективность его действия, вероятно, связана с тем, что

железо и никель, которые образуют комплекс, входят в состав ферментов, отвечающих за

процессы вторичного метаболизма дрожжей (ISAC, 1992; ЗАЛАШКО, 1999). Таким

образом, внесение координационного соединения железа в питательную среду

концентрацией 1,0 мг/л, способствует увеличению содержания торулина на 72 % по

сравнению с контролем (рис.4.6 (б)).

Содержание торулародина в клеточной массе пигментных дрожжей, согласно

полученным результатам, варьирует от 46,5 до 69,4 мкг/г с.в., в зависимости от

концентрации и природы используемого соединения.