Рубин А.Б. Современные методы биофизических исследований (Практикум по биофизике)

Подождите немного. Документ загружается.

Глава

III

Лазерная спектроскопия

Фотобиологические реакции, к которым относится, в частности, фо-

тосинтез, инициируются светом, поглощаемым молекулами пигмен-

тов. Процессами, исследуемыми

пикосекундной

наносекундной

ла-

зерной

спектроскопией,

являются миграция энергии по пигментным

молекулам,

захват

возбуждения фотоактивными реакционными цент-

рами

(ФРЦ),

разделение зарядов в последних, перенос электрона

но

электрон-транспортной цепи. Диапазон скоростей этих процес-

сов довольно широк — 10~

— 10

с; их исследование

требует

соответствующего аппаратурного обеспечения.

Как

правило, пигментные комплексы (ПК), обеспечивающие энер-

гией электронного возбуждения ФРЦ, являются образованиями, ин-

тенсивно поглощающими свет видимого диапазона спектра. Поэто-

му поглощение одного или нескольких фотонов и реализация одно-

го или нескольких возбужденных состояний ПК не вызывает замет-

ных изменений в его спектре поглощения. С

другой

стороны, кван-

товые

выходы

флуоресценции молекул ПК, как правило, значитель-

ны

достигают

0,1—0,01.

Поэтому изучение миграции энергии по

молекулам ПК проводят главным образом методом пикосекундной

флуорометрии.

результате

многочисленных актов переноса электронное воз-

буждение, возникшее в ПК, захватывается ФРЦ, так что его фото-

активный пигмент переходит в возбужденное состояние. Непосред-

ственно после локализации возбуждения на фотоактивном пигмен-

те ФРЦ за время < 10~

с происходит разделение зарядов: отрыв

электрона от возбужденной молекулы — донора и перенос его на

первичный акцептор.

111

Как

правило, ФРЦ представляет собой пигмент-белковое образо-

вание существенно меньших размеров, чем ПК, и содержит 2—6 мо-

лекул

пигмента. В

результате

разделения зарядов в ФРЦ возника-

ют два радикала, спектры поглощения которых сильно отличаются

от спектров исходных молекул. Поэтому проводить исследование ре-

акции

разделения зарядов в ФРЦ предпочтительнее методом

пико-

секундной абсорбционной спектроскопии. Хотя квантовый

выход

флуоресценции фотоактивного пигмента ФРЦ

низок

(^ 10~

) и

прямая

регистрация кинетики флуоресценции сопряжена со значи-

тельными трудностями, метод импульсной пикосекундной флуоро-

метрии также является информативным инструментом в изучении

разделения и первичной стабилизации зарядов в ФРЦ.

Дальнейший перенос электрона по электрон-транспортной цепи

ФРЦ

вообще не сопровождается флуоресценцией, поэтому абсорбци-

онные

спектрометры пикосекундного и более медленного диапазо-

нов

(в совокупности с методами магнитного резонанса) — абсолют-

но

необходимый инструмент в изучении этого процесса.

На

каждом этапе локализации электрона на переносчиках

ФРЦ возможна рекомбинация разделенных зарядов, в

результате

чего

вновь образуется возбужденное состояние фотоактивного пиг-

мента. Это возбуждение с определенной вероятностью возвращается

ПК и высвечивается в виде флуоресценции ПК, сам фотоактивный

возбужденный пигмент может перейти в основное состояние с ис-

пусканием кванта света или в нем произойдет разделение зарядов.

Ясно,

что рекомбинацию зарядов в ФРЦ можно исследовать как

методом пикосекундной флуорометрии, так и методом абсорбцион-

ной

спектроскопии.

Таким

образом, пикосекундную флуорометрию используют при

исследовании миграции энергии в ПК,

захвата

возбуждения ФРЦ,

возврата его из ФРЦ в ПК, разделения зарядов и рекомбинации раз-

деленных зарядов. Абсорбционная спектроскопия необходима для

изучения реакции разделения и рекомбинации зарядов, а также пос-

ледующего

переноса электрона по электрон-транспортной цепи ФРЦ.

методам лазерной спектроскопии относится также

спектроско-

пия

комбинационного

рассеяния

(КР), с помощью которой можно ис-

следовать природу межмолекулярных взаимодействий.

В основе метода КР лежит явление

неупругого

рассеяния света

молекулами исследуемого вещества. При этом если образец воз-

буждается

монохроматическим излучением с частотой ы

, то за

счет

неупругого

взаимодействия света с молекулами образца часть

энергии

возбуждающего

излучения рассеивается в виде излучения,

спектр которого является суперпозицией колебаний

всех

типов моле-

кул исследуемой системы.

Иными

словами, спектр рассеянного из-

лучения представлен набором линий ш

, ш

± со,-, где со,- — часто-

ты нормальных колебаний молекулы.

В свою очередь, частоты нормальных колебаний молекулы

(набор колебательных мод определенного электронного уровня)

112

зависят от природы межмолекулярных взаимодействий, в которые

вступает исследуемая молекула. Именно поэтому спектроскопия

КР

как средство тонкого исследования природы межмолекулярных

взаимодействий органических и неорганических молекул привле-

кает внимание ученых различных специальностей.

В настоящее время

существует

несколько разновидностей спект-

роскопии

КР. При возбуждении излучением с частотой, не попадаю-

щей

в полосы поглощения молекул, наблюдается спонтанное КР,

интенсивность

которого составляет 10-' — 10~

от интенсивности

возбуждающего света. При попадании частоты возбуждающего из-

лучения в полосу поглощения интенсивность линий в спектре КР

тех атомов и групп молекул, чей вибронный переход оказывается

резонансе, усиливается (в 10

— 10

раз). Это явление названо

резонансным

комбинационным

рассеянием

(РКР).

В последние годы реализована возможность записи полного спект-

ра КР за короткие, вплоть до 10~

с, интервалы времени при им-

пульсном возбуждении молекул. Такая разновидность спектроско-

пии

КР называется

динамическим

КР.

Ниже

будут

подробно описаны основы метода спектроскопии КР

используемые экспериментальные установки. Но вначале необ-

ходимо рассмотреть основные сведения о лазерах.

Обычно лазеры классифицируют по типу лазерного материала и

методу создания инверсной населенности в активной среде. Лазе-

ры

работают как в непрерывном, так и в импульсном режимах.

В импульсном режиме достигаются наибольшие значения мощности

излучения.

Можно выделить три

типа

импульсных

режимов.

Нормальный

режим,

или

режим

свободной

генерации.

В этом

случае

электрический импульс подается на импульсную лампу на-

качки

(твердотельный лазер) или на плазменную

трубку

(газовые

лазеры).

Длительность импульса в этом режиме меняется от 10~

до 10~

с, а пиковая мощность может достигать десятков мегаватт.

Режим

модуляции

добротности,

при котором для получения

мощного

короткого импульса света используют ячейку Поккельса

(вращение

плоскости поляризации под действием электрического

поля)

или насыщающиеся поглотители. Длительность импульса

таких лазерах составляет 10-' — Ю-

с, пиковая мощность дости-

гает

100 МВт.

Режим

синхронизации

мод основан на перераспределении

энергии

электромагнитной волны внутри резонатора

между

прост-

ранственно

сближенными частотными компонентами, что приводит

формированию ультракоротких импульсов. Длительность им-

пульса составляет 100 фс ~- 1 не, мощность — 10* — 10

Вт.

В электрическом разряде инверсия населенностей возникает

результате возбуждения атомов или молекул электронным ударом.

Примерами

газовых лазеров

могут

служить гелий-неоновый лазер

(^ = 0,6; 1,1; 3,4 мкм), аргоновый лазер (А, = 0,5 мкм) и СО

-ла-

зер (Я = 10 мкм).

113

В полупроводниках

при

инжекции неосновных носителей

соз-

дается инверсия населенности

тонком переходном слое, распо-

ложенном

между

двумя

областями полупроводникового кристал-

ла,—область

повышенным содержанием электронов (л-область)

«дырок»

(р-область).

В химических лазерах источником инверсной населенности

яв-

ляется химическая реакция,

результате

которой образуются

ато-

мы,

молекулы

или

химические радикалы

возбужденном состоя-

нии.

Наиболее распространенным химическим лазером является

лазер,

котором

качестве рабочего вещества используется

CF,I.

Энергия

импульсе такого лазера составляет сотни джоулей.

В лазере

на

органических красителях используется широкая

полоса люминесценции этих веществ; диспергирующий элемент

(призма

или

дифракционная решетка), выделяя необходимый спект-

ральный

участок, производит перестройку частоты излучения.

В параметрических генераторах света применяют анизотропные

кристаллы,

которых

результате

нелинейно-оптического преоб-

разования

происходит изменение длины волны возбуждающего

света

зависимости

от

ориентации кристалла.

Таким

образом, современные оптические квантовые генераторы

позволяют получать монохроматическое слаборасходящееся

мощ-

ное

излучение почти

во

всех

участках

электромагнитной шкалы,

на-

чиная

от

у-излучения

до

глубокого ИК-диапазона

1. Основы метода импульсной флуорометрии

момента получения пикосекундных (10~

с)

импульсов света

Г.

В.

Моккером

и Р. Дж.

Коллинзом

(1965)

от

рубинового лазера

А. Дж. Де

Марией

(1966)

от

неодимового лазера техника

их

генерации

непрерывно совершенствовалась.

настоящему времени

методы генерации достигли такого уровня,

что

стало возможным

надежное получение импульсов, длительность которых определяет-

ся

обратной шириной спектра излучения активных молекул.

Так,

рубиновый лазер генерирует импульсы длительностью

~ 30 пс,

лазер

на

фосфатном стекле

неодимом

~Л пс,

квазинепрерыв-

ные

лазеры

на

красителях

~0,3 пс.

Процессы синхронизации

мод,

при

которых

на

выходе

лазера получается последовательность

им-

пульсов свега пикосекундной длительности, детально исследованы

экспериментально

теоретически описаны

целом ряде общедоступ-

ных обзоров.

Интенсивное

развитие техники

теории генерации сверхкорот-

ких световых импульсов определяется

тем, что эти

импульсы

пре-

доставляют уникальные возможности

изучении процессов, проис-

ходящих

при

взаимодействии света

веществом

протекающих

за

10~

— 10~

с.

Осуществление этих исследований потребовало

развития

традиционных методов динамической спектроскопии

(абсорбционной

флуорометрии)

до

качественно нового уровня;

114

fit)

Kit)

<P(t)

Рис.

40.

Схема метода импульсной флуорометрии:

—

импульсный

источник света, 2 — светофильтры, 3 — образец, 4 — регистратор; Ht)—

возбуждающий

импульс света, <р(() — характеристическая функция флуоресценции,

K(l)

—аппаратная характеристическая функция, Ф(() — регистрируемый сигнал

возникли

новые методы исследования

пикосекундным разреше-

нием.

Импульсная

флуорометрия

представляет собой метод прямого

наблюдения кинетики затухания флуоресценции.

При

этом корот-

кий,

достаточно мощный импульс света, попадая

на

образец,

соз-

дает

высокую концентрацию возбужденных состояний исследуемых

молекул, радиационная дезактивация которых

во

времени регист-

рируется фотоприемниками. Следовательно, основными элементами

импульсного флуорометра являются источник света

для

возбужде-

ния

флуоресценции, светофильтры

или

иные селектирующие спектр

приборы

система регистрации

(рис. 40).

Флуоресценция

возбуждается импульсом света

/ (t),

длитель-

ность

которого выбирается меньше времени жизни флуоресцентного

состояния

исследуемых молекул.

основе анализа регистрируемого

сигнала флуоресценции лежат представления

об

аппаратной

и ха-

рактеристической функциях. Аппаратная характеристическая функ-

ция

(АХФ) К (t)

определяется

как

частотной характеристикой

си-

стемы регистрации,

так и

параметрами возбуждающего импульса

(t). Вид АХФ

легко установить, если

на

вход

системы регистра-

ции

подать импульс света

от

источника возбуждения

зарегистри-

ровать сигнал

на

выходе.

При

измерении длительности флуоресценции

на

выходе

регист-

рирующей системы детектируется сигнал

Ф (t),

который можно пред-

ставить

виде свертки характеристической функции флуоресцен-

ции

ф (t),

определяемой

как

интенсивность флуоресценции,

воз-

буждаемой

момент времени

t = 0

б-образным импульсом света,

АХФ К (t):

K(t-t')<p(t')dt'.

(III.1.1)

115

Таким

образом, экспериментально измеряемыми являются функ-

ции

К (0 и Ф (/),

тогда

как в действительности необходимо опре-

деление функций ф (/). К сожалению, никакого удобного аналити-

ческого метода нахождения функции ф (/) по экспериментально

наблюдаемым К (t) и Ф (t) не

существует

и на практике используют

различные приближения.

Если АХФ К (t) можно считать 6-функцией по отношению

Ф (t), то уравнение (III.1.1) легко упрощается:

Ф(0 = J

K(t-t')q>(t')dt'

Иными

словами, регистрируемый сигнал Ф (t) является

характе-

ристической

функцией

флуоресценции

и обработка результатов из-

мерений крайне проста.

В том случае, когда длительности АХФ и флуоресцентной ха-

рактеристической функции сравнимы, нахождение ф (t) по К (О

Ф (t) более трудоемко. Рассмотрим процедуру определения

(/), для случая, когда ее можно представить в виде суммы экспо-

нент:

ФЧ0

6<0

Ле-'

/т

6(0 =

где A

и i

— искомые параметры, т — число компонентов.

В этом

случае

модельная кинетика определяется следующим обра-

зом:

У ОФ

<О«И'. (III.1.3)

(III.1.4)

Введем

функционал среднеквадратичной ошибки

где Ф?

ксп

— экспериментальные значения функции Ф (0, полу-

чаемые из измеренных кривых в момент времени t = i; в эти же

моменты времени Ф; (A

, t

) — значения модельной кривой.

Алгоритм

подбора модельной кинетики основан на минимиза-

ции

функционала среднеквадратичной ошибки, который представ-

ляет собой сложную функцию параметров A

и r

, k = 1, ..., от,

где т — число компонентов.

Существует

много способов минимизации функционалов, завися-

щих от нескольких переменных. Один из вариантов обобщенного

метода Ньютона —

метод

затухающих

наименьших

квадратов

Ле-

венберга

— обеспечивает, с одной стороны, высокую сходимость, а

другой

— обладает высокой устойчивостью к неточности задания

116

начальных значений параметров, так как при приближении к ми-

нимуму вариации параметров

затухают.

На

начальном этапе решения задачи в память машины вводят

экспериментальную кинетику, аппаратную функцию, число компо-

нентов т, начальные значения параметров А

, т

, k= 1, ...,m.

При

этом число компонентов выбирают с

учетом

априорных

данных об исследуемой системе; в процессе вычислений параметры

можно фиксировать, что полезно при подборе начального прибли-

жения.

Вычисления производят до тех пор, пока функционал сред-

неквадратичной ошибки не станет меньше величины, характери-

зующей норму ошибок эксперимента.

2. Метод пикосекундной абсорбционной спектроскопии

В основе метода динамической абсорбционной спектроскопии лежит

использование

двух

коротких импульсов света, с помощью которых

изучают

изменение оптической плотности образца (рис. 41). Один

из

импульсов U

, имеющий

достаточную

мощность, называется воз-

буждающим

служит

для инициирования изменения абсорбцион-

ных характеристик образца. Другой, более слабый по интенсивно-

сти, является

зондирующим

и используется для регистрации изме-

нений

спектров поглощения, вызванных возбуждающим импульсом.

Как

правило, зондирующий импульс делят на два:

пробный

и им-

пульс

сравнения,

— которые проходят через разные участки иссле-

дуемого

образца. Пробный импульс распространяется через об-

ласть, в которой исследуется возмущение оптической плотности,

вызванное возбуждающим импульсом; импульс сравнения посы-

лается через невозмущенную область.

На

интенсивности импульсов, используемых в абсорбционной

спектроскопии,

накладываются определенные ограничения. Интен-

сивность

возбуждающего

импульса не должна превышать порого-

вую для нелинейных эффектов (аннигиляция, многоквантовые про-

цессы),

однако она должна быть достаточной, чтобы вызвать ощу-

Рис.

41. Схема метода дифференциальной абсорбционной спектроскопии:

— импульсный источник света, 2 — линия задержки, 3 — образец, 4 — регистратор, 5 —

фотодиоды, К\ и А.2 — возбуждающий и зондирующий свет, 3i—3, — зеркала ,

117

тимые изменения в спектре поглощения. Интенсивность зондирую-

щего импульса должна быть настолько низкой, чтобы вызываемые

им

изменения поглощения были незначительны по сравнению с из-

менениями,

обусловленными возбуждающим импульсом. Однако

интенсивность зондирующего импульса должна быть достаточной,

чтобы в эксперименте надежно регистрировать его изменения.

В настоящее время сформировались два

основных

подхода

в пи-

косекундных абсорбционных измерениях. В одном из них исполь-

зуют

два импульса света с фиксированными длинами волн, однако

время прихода зондирующего импульса относительно возбуждаю-

щего может варьироваться в широких

пределах.

Такая модифика-

ция

абсорбционного спектрометра позволяет измерять кинетику воз-

никновения

и исчезновения полосы поглощения, возникшей в ре-

зультате

поглощения мощного импульса

возбуждающего

света.

Другой

подход

в пикосекундной абсорбционной спектроскопии

связан

с реализацией возможности построения мгновенных спект-

ров поглощения исследуемого соединения. В этих опытах также

используют два импульса света: возбуждающий (с определенной

либо перестраиваемой длиной волны) и зондирующий (представлен-

ный

широкой спектральной полосой излучения). При этих измере-

ниях

варьируется временная задержка

между

двумя

импульсами.

При

такой постановке экспериментатор

будет

регистрировать спектр

поглощения исследуемого соединения спустя kt после возбуждения.

результате

можно

будет

определить спектр поглощения соедине-

ний,

участвующих

в неких темновых реакциях (например, в реак-

циях переноса электрона), и установить последовательность пере-

носчиков

и их природу.

Каким

образом измеряют изменения оптической плотности образ-

ца, индуцированные лазерным импульсом? Как видно из рис. 41,

дифференциальном абсорбционном спектрометре измеряемыми ве-

личинами являются энергия пробного импульса и энергия импульса

сравнения.

Так как интенсивность лазерного импульса нестабиль-

на

от вспышки к вспышке, то в эксперименте измеряется отношение

энергии

импульса сравнения и пробного. Для непрерывкой привяз-

ки

результатов

к нулевому уровню последовательно регистрируется

отношение энергии импульсов сравнения и пробного в присутствии

возбуждающего

импульса и без него.

Пусть £/,, U

и U*, и\ —энергия импульсов сравнения и проб-

ного в

отсутствие

и при наличии

возбуждающего

импульса соот-

ветственно. Изменение оптической плотности

будет

определяться

следующим выражением:

Очевидно, основным источником погрешностей в определении АЛ

является непостоянство отношения энергии импульсов сравнения и

пробного. Для уменьшения величины погрешности обычно вводят

автоматический отбор лазерных импульсов по энергии. При этом,

118

если значения энергии возбуждающего

пробного импульсов

не по-

падают

наперед заданные энергетические ворота,

эти

эксперимен-

тальные данные

не

используют

расчетах.

Кроме того,

реальном

опыте осуществляется накопление

усреднение эксперименталь-

ных данных,

что

при

накоплениях

в \^N раз

увеличивает

точ-

ность

определения

АЛ.

Ошибка

определении изменения оптической плотности

АЛ

при

накоплениях определяется следующим выражением:

где

—среднее значение оптичес-

кого пропускания;

Sl(2)=——

г iu

-u

) (u

-uj

4X2

U\ и Щ —

усредненные

за N

накоплений энергии импуль-

сов сравнения

пробного

отсутствие

при

наличии возбуждаю-

щих импульсов соответственно;

—

коэффициент корреляции.

Обычно

во

время измерений задаются пределы флуктуации энер-

гии

возбуждающего

зондирующего импульсов,

также либо

чис-

ло накопленией

либо точность измерения

АЛ.

Для

того чтобы

уменьшить влияние нестабильности длительности лазерных импуль-

сов

(At),

ухудшающих

временное разрешение спектрометра, разра-

ботан метод автоматической селекции лазерных импульсов

по

дли-

тельности.

Способ

селекции лазерных импульсов

по

длительности

Способ

относительного контроля изменения длительности

пико-

секундных импульсов

и их

отбора

заданных пределах основан

на

нелинейном оптическом эффекте генерации второй гармоники.

Использование

этого метода стало возможным благодаря созданию

автоматизированной

системы управления

сбора информации

аб-

сорбционном

спектрометре

на

базе микропроцессорной техники.

Интенсивность

второй гармоники

для

пучка света

гауссовым

профилем

поперечном сечении, если пренебречь истощением

об-

ратной

реакцией второй гармоники

на

накачку (коэффициент преоб-

119

разования во

вторую

гармонику < 3 %),

будет

определяться вы-

ражением

Здесь р

—

радиус

пучка; / — длина кристалла; АЛ = k

—

— 2k

— фазовая расстройка; ц.

, е

— магнитная и электри-

ческая постоянные; со — циклическая частота электромагнит-

ной

волны излучения второй гармоники лазера; с1

эф

— эффектив-

ное значение тензора; Р

— мощность возбуждающего света; п —•

показатель преломления.

Временной профиль пикосекундного импульса, получаемого на

выходе

лазера с самосинхронизацией мод, можно описать функцией

Гаусса:

где т — длительность импульса по полувысоте.

Учитывая, что регистрируемая фотоприемниками энергия

будет

определяться как

ехр(—Р/т*)д1=-Р

Упт,

(Ш.3.3)

можно получить

следующее

соотношение:

где М с

учетом

(III.3.1) определяется из соотношения

М =

2u)

/(P

)

(II

1.3.4)

Таким

образом, измеряя величины £*• и

2<0

можно контролиро-

вать относительное изменение т и вводить отбор по длительности

импульса в процессе эксперимента. Соотношение (III.3.4) справед-

ливо в том случае, если длительность импульса основной частоты

равна длительности импульса второй гармоники

2га

Из

приведенных данных можно сделать вывод, что, используя

генератор второй гармоники на кристалле дигидрофосфата калия

KDP

в одномодовом пучке, можно при наличии автоматизированной

системы вводить отбор по длительности пикосекундного импульса.

Относительная величина флуктуации энергии зондирующего

импульса определяется следующим выражением:

6(/

/(Л, = (2

+ (5) ехр [(-

120