Рубин А.Б. Современные методы биофизических исследований (Практикум по биофизике)

Подождите немного. Документ загружается.

(«in

Линейная

поляризация

Кругодая

поляризация

Рис.

5. Круговая поляризация света

Существуют

понятия амплитуды А и интенсивности / электро-

магнитной волны. Если электромагнитная волна плоскополяризо-

вана, то / ж А

Для того чтобы понять, каким образом может возникать цир-

кулярно поляризованный и эллиптически поляризованный свет,

рассмотрим пучок плоскополяризованного света вдоль направления

его распространения, когда ось х расположена перпендикулярно

плоскости рисунка (рис. 5). Результирующий электрический век-

тор Е можно охарактеризовать

двумя

взаимно перпендикулярными

составляющими Е

и Е

(т. е. проекциями на оси у и z). Тогда ес-

ли компоненты электрического вектора Е

= Е

sin (at и E

sin

at находятся в одинаковой фазе, то Е, меняясь по синусо-

иде, остается в одной плоскости под

углом

я/4 к каждой оси и рас-

пространяется вдоль оси х. Таким образом, в данном

случае

свет

будет

плоскополяризованным (рис. 5, А).

Если на пути света поместить поляризатор (например, кристалл,

обладающий двулучепреломлением) с различными показателями

преломления для компонентов Е

и Е

и если свойства поляриза-

тора (например, толщина кристалла) таковы, что компонент Е

будет

опережать E

на л/2 [Е„ = Е

sin со/; E

= Е

sin x

(u>t

—

я/2)],

то эта величина сдвига фаз приведет к

следующему

явлению. Компоненты Ej, и Е

будут

изменяться по синусоиде та-

ким

образом, что результирующий вектор Е начнет вращаться по

кругу

вправо (по часовой стрелке), а его конец — описывать спираль

вдоль направления оси распространения х и свет станет циркулярно

поляризованным (поляризованным по

кругу,

рис. 5, Б; рис. 6).

Если

угол

опережения Е

относительно Е

составит я, то свет

снова

будет

плоскополяризованным, но плоскость его поляриза-

Рис.

6. Циркулярно поляризованная световая волна, распространяющаяся

вдоль оси х (конец вектора описывает спираль)

ции

окажется перпендикулярной плоскости поляризации света для

-случая, когда Е,, и E

находятся в одинаковой фазе (рис. 5, В).

Когда, наоборот, E

опережает по фазе Е„ на я/2, т. е. Е

= Е

Xsin

at, а Е

= Е

sin

(u>t

— л/2), свет окажется

циркулярно

поля-

ризованным,

однако результирующий вектор Е

будет

вращаться по

кругу

влево (против часовой стрелки), описывая своим концом спи-

раль вдоль направления оси распространения световой волны

(рис.

5, Г).

Опережение (запаздывание) одного из компонентов на любой

другой

угол,

отличный от рассмотренных выше,

будет

приводить к

эллиптической

поляризации

света,

когда конец результирующего

вектора Е

будет

описывать эллипс.

Таким

образом, в общем

случае

сдвиг по фазе

между

компонента-

ми

и Е

приводит к возникновению эллиптической поляризации

света с вращением конца вектора Е по часовой стрелке или против

нее по эллипсу и распространением волны вдоль оси х. Эллиптиче-

ская

поляризация вырождается при сдвиге фаз компонентов на

л/2 в

круговую

поляризацию,

а при совпадении по фазе или сдвиге

на

я — в

линейную

поляризацию.

Все методы поляризационной спектроскопии основаны на том

принципе,

что индивидуальные молекулы в зависимости от своего

химического строения, а также более крупные молекулярные струк-

туры (агрегаты, макромолекулярные комплексы, кристаллы и т. п.)

могут

по-разному поглощать свет, отличающийся характером своей

поляризации.

Так, молекулы с определенной химической

структу-

рой оказываются способными различным образом поглощать ли-

нейно

поляризованный свет, который отличается ориентацией пло-

скости поляризации. Существуют также и так называемые

хираль-

ные

молекулы,

обладающие элементами спиральной структуры; эти

молекулы преимущественно поглощают свет с правой или левой

круговой поляризацией. Таким образом, использование методов по-

ляризационной

спектроскопии может дать информацию о структур-

ных особенностях и конформационных свойствах как индивиду-

альных молекул, так и более сложных макромолекулярных комп-

лексов.

Хорошо известно, что различные электронные переходы в мо-

лекулах

проявляются в виде полос поглощения, положение которых

интенсивность позволяют в ряде

случаев

получить информацию о

химическом строении вещества и количестве поглощающих моле-

кул.

Сила осциллятора, пропорциональная квадрату момента пере-

хода:

Ilit/!

. является мерой интенсивности поглощения.

Дипольный момент

перехода

ориентирован определенным образом

относительно осей молекулы и является вектором ц, который опре-

деляет направление и силу диполя.

Если плоскополяризованный свет падает на молекулы, которые

определенным образом ориентированы по отношению к плоскости

световых колебаний, то длина волны и коэффициент поглощения

будут

зависеть от этой ориентации.

Обычно коэффициент поглощения имеет значительную величи-

ну, только если колебания световой волны совершаются параллель-

но

плоскости молекулы, и максимален, если такие колебания ориен-

тированы параллельно длинной оси молекулы, поскольку затраги-

вают

«наибольшее протяжение» электронной оболочки. В том слу-

чае, когда колебания световой волны становятся перпендикуляр-

ными

по отношению к рассмотренным выше, т. е. происходят вдоль

меньшего протяжения скелета молекулы, поглощается уже

другая

длина волны с

другим

коэффициентом поглощения. Такое явление,

установленное ранее на кристаллах, называется

дихроизмом.

Молекулы, содержащие систему сопряженных двойных связей

эллиптического типа с делокализацией л-электронов,

обладают

дву-

мя

основными типами колебаний с взаимно перпендикулярными ди-

польными моментами, ориентированными соответственно вдоль длин-

ной

и короткой осей эллипса. Если вектор электрического поля Е

параллелен

соответствующему

дипольному моменту

перехода

ц,

то интенсивность данной полосы поглощения

будет

максимальна. В

том

случае,

когда поглощающие молекулы не ориентированы (на-

пример,

в растворе), использование поляризованного света позво-

ляет оценить только усредненную в пространстве величину момен-

та

перехода.

По этой причине для получения данных о внутримоле-

кулярной ориентации р используют ориентированные образцы.

Методы такой ориентации весьма разнообразны и определяются

спецификой

объекта. Образцы

могут

быть ориентированы в гидро-

динамическом потоке; при действии магнитных и электрических

полей; в монослоях на поверхностях раздела фаз; при высушивании

растянутых пленках; при механической деформации полиакрила-

мидного геля, содержащего объект, и т. п. При исследовании кри-

сталлических образований используют их естественную молекуляр-

ную ориентацию.

Метод

линейного дихроизма

Метод

линейного

дихроизма

— это

измерение поглощения ориен-

тированным объектом линейно поляризованного света, дающее

воз-

можность определить углы, которые различные моменты

ц,

образу-

ют

одной

или

несколькими осями симметрии образца.

В том слу-

чае, когда вектор

образует некоторый

угол

вектором

ц,

вероят-

ность поглощения пропорциональна косинусу

угла

между

ними

(cos

8). С

учетом того,

что

интенсивность плоскополяризованной

электромагнитной волны пропорциональна квадрату величины

электрического вектора

(/ —

тах

), вероятность поглощения

про-

порциональна E

cos9,

где (л

cos в

связан

молярным

коэффи-

циентом экстинкции.

При

исследовании линейного дихроизма

ориентированный объект освещается измеряющим светом,

по-

ляризованным

двух

взаимно перпендикулярных плоскостях.

В одном

случае

плоскость поляризации выбирается параллельной,

другом

—

перпендикулярной

оси

ориентации образца.

Линейный

дихроизм характеризуется величиной степени дихро-

изма

Р — (Л|| — A

)l (Л||

-+-

), где Л|| и А

соответствуют

поглощению

при

поляризации измеряющего света параллельно

перпендикулярно направлению

оси

ориентации. Часто

для

характе-

ристики

поляризации поглощения используют величину линейного

дихроизма

(LD — АЛ = Лу — Л

) или

дихроичного отношения

Лц/Л

). Преимущество измерения дихроичного отношения

том, что эта

величина

не

зависит

от

формы полосы поглощения.

Рассмотрим,

как

зависит поглощение ориентированного образца,

обладающего осью симметрии,

от

взаимоориентации дипольного

момента перехода

электрического вектора падающего

на

объект

плоскополяризованного света. Пусть вектор момента перехода

\и

направлен

под

некоторым углом

6 к оси

ориентации

у и

случай-

ным

образом ориентирован вокруг этой

оси, а

электрический

век-

тор действующего

на

объект линейно поляризованного света направ-

лен

одном

случае

параллельно,

а в

другом

—перпендикулярно

оси

у (рис. 7, Л).

В первом случае, когда вектор

параллелен

оси

ориентации,

-••

~- ЗА

cos

в, где Л —

поглощение

для

случайной

ори-

ентации (неориентированный образец).

Во

втором случае, когда

перпендикулярен

оси у и

лежит

плоскости

гх, А

гх

— А

(3/2) Л

sin

9. Если измеряющий свет поляризован

плоскости,

параллельной плоскости

гх, то Лц ^ (3/2) Л

sin

0. Когда свет

поляризован перпендикулярно плоскости

zx, A

-= ЗЛ

cos

В этом

случае

LD = ЗЛ

1(1/2)

sin

—

cos

- ЗЛ [(1 -

3cos

9)'21;

—-

0'2.

Угол

может принимать любое значение

от 0 до л/2;

D определяет параметры

так

называемого «усредненного перехода»,

ориентированного таким образом,

что

поляризация

его

поглощения

совпадает

регистрируемой

эксперименте поляризацией погло-

щения

всего образца.

Рис.

7. Линейный дихроизм

для образца с осевой

симметрией

(А) и плоскостной (Б)

При

хаотической ориентации электронных переходов D -•- 1

<Оц

и 6 =

arctg

(±1/2) « 54° 40'. Если

угол

0 >

54°40',

то

D> 1; при 0 <

40'

D <. 1. При идеальной ориентации, когда

все электронные переходы ориентированы строго параллельно пло-

скости zx (0 = л/2), дихроичное отношение бесконечно. Если все

электронные переходы ориентированы перпендикулярно (0 — 0),

то D = 0.

Величина q •-• (1 — 3 cos

0)/2 называется

параметром

порядка

часто используется для описания степени упорядоченности образ-

ца. Если л/2 > 0 >

54°40',

то 1/2 > q > 0; при 0 <

54°40\

вели-

чина q становится отрицательной. Параметр порядка связан с вели-

чиной

линейного дихроизма и дихроичного отношения следующими

соотношениями:

=-•

3 Aq; D -(1 + q)l (I — q).

Существуют

молекулы, имеющие плоскость симметрии. В этом

случае

векторы

моментов \л в такой плоскости К раскладываются на пару одинако-

вых взаимно перпендикулярных моментов, обладающих равной часто-

той и дающих одну полосу поглощения (так называемое

плоско-

стное

вырождение

момента перехода). Когда при этом наблюдается

также ориентация с осевой симметрией, можно оценить

угол

0 меж-

ду осью у и нормалью п к плоскости вырождения К- Из соотноше-

ний

•-•--=

= (3/2) A

sin

гх

= ЗА (1 +

cos

0)/4

получим, что D = 2

sin

0/(1 + cos

G) (рис. 7, Б).

На

ряде объектов (например, на фрагментах фотосинтетических

мембран) осевая ориентация может быть получена при их высушива-

нии

на плоской поверхности. В соответствии с вышеприведенными

рисунками эта поверхность является плоскостью zx и в этом

случае

экспериментальное определение величины А

оказывается невоз-

можным, так как при параллельной ориентации Е оси у измеряю-

щий

свет должен проходить через боковую поверхность исследуе-

мого образца (в ребро). Однако оказывается возможным определить

величину A

(свет распространяется вдоль оси у, а электрический

вектор расположен в плоскости zx) и величину Лр (свет распростра-

Рис.

Модели ориентации

(А, Б)

макромолекулярных комплексов, возникаю-

щей

при

деформации полиакриламидного геля

няется

внутри образца

под

некоторым

углом

р* к оси z,

вектор

составляет

угол

плоскостью

гх),

используя соотношения

Л„ cos

Pi Л

!х

sin

Р; Ац/А

1Х

(Л„/Л

2Л

.) cos

p -f

sin

Как

было отмечено выше, одним

из

способов ориентации объек-

тов является

ориентация

полиакриламидном

геле.

Разработанный

впервые

нашей стране

(И. А.

Абдурахманов,

Ю. Е.

Ерохин),

этот метод основан

на том, что

исследуемые образцы заключаются

поры геля

и при его

механической деформации происходит преиму-

щественная ориентация объекта. Метод ориентации

полиакриламид-

ном

геле

большим успехом применяется

для

таких объектов,

как

мембранные везикулы

макромолекулярные комплексы.

В ка-

честве меры деформации

при

ориентации образцов берется величи-

на

N --

///„,

где /„ и / —

начальная

конечная длина геля.

При

механической деформации геля мембранные везикулы изменяют

свою форму.

Так,

сферические хроматофоры фотосинтезирующих

бактерий принимают форму эллипсоида вращения

поверхности

мембран преимущественно ориентируются вдоль

оси

растяжения.

Степень дихроизма

пигментов

учетом

угла

между

моментом

перехода

нормалью

плоскости мембраны рассчитывают

сле-

дующим образом:

(Зх—1) (3cos

a—1)

где

— -

3— х+(3х— l)cos

^—1)] arctg

(l/V.V*— 1)- 1

—1

[/уз

(Л

™_1)]

arctg (l/T/jV

—1)+1

случае

ориентации

полиакриламидном

геле

макромолекуляр-

ных комплексов

и, в

частности, пигмент-белковых комплексов фото-

синтезирующих организмов можно также определить величину

сте-

пени

дихроизма пигментов. Такие комплексы хорошо аппроксимиру-

ются достаточно жесткими частицами, имеющими форму трехосного

эллипсоида вращения

(рис. 8, Л). При

одноосной деформации геля

вследствие механического сдвига длинные

оси F

эллипсоидов обыч-

но

ориентируются

направлении растяжения

пор

геля.

Обозначив через а'

угол

между

длинной осью F и моментом пере-

хода

ц, можно показать, что

(3</-l)(3cos*a'-l)

где

3—1/ + (3(/— I) cos

I !_

Л/

—

•

arctg ]/Л'

- ] V

Если момент перехода описывается ротатором (как, например, для

гемов цитохромов), то можно определить ориентацию плоскости ро-

татора. Степень дихроизма вычисляют в этом

случае

по формуле

(Зу—1) (Ssin^p—2)

2(3—i/)

+ (3i/-i)sin

P '

где fS —

угол

между

длинной осью макромолекулы и нормалью к

плоскости ротатора.

Согласно другой модели ориентации в полиакриламидном геле,

пигмент-белковые комплексы рассматриваются в виде эллипсоидов

вращения дискообразной формы. Результаты расчетов, так же как и

описанных выше случаях, хорошо согласуются с эксперименталь-

ными

данными. Предлагаемая модель ориентации проиллюстриро-

вана на рис. 8, Б. Дипольный момент перехода пигмента в комплек-

се |и образует

угол

<р с плоскостью диска, его проекция на эту пло-

скость —

угол

а с направлением сдвига F (направлением вытягива-

ния

геля), а нормаль к этой плоскости п образует

угол

р" с направ-

лением М и

угол

0 с направлением N. В идеальном случае, когда

система полностью упорядочена (т. е. направление F проходит через

плоскость диска),

угол

в — л/2. При регистрации в направлении

Л/ поглощение света, поляризованного параллельно и перпенди-

кулярно направлению сдвига F, определяется выражениями А

(fiF)

;

(цМ)

где (fiF)

и (цМ)

— квадраты проекции

вектора ц на оси F и М соответственно, a F и М — единичные

векторы вдоль лабораторных координат. После усреднения по уг-

лам а и р и вычисления

--, ((ш

/ 2) cos

; А

=.-.

(ц,

/2) (1 — cos

<p/2).

Дихроичное отношение D — А

/А

для такой системы изменя-

ется от 0 при ф л/2 до 2 при ф = 0. Если ф « 35

, то D

-•-

1, т.е.

- А

, и переходы, моменты которых составляют

угол

ф > 35

будут

преимущественно поглощать перпендикулярно поляризован-

ный

свет (D < 1), тогда как при Ф < 35° D > 1.

Поскольку величины линейного дихроизма (АЛ) и поглощения

(А) легко измеримы, для вычисления

угла

ф можно использовать

соотношение

Л.,,

Рис.

Схема установки

для

измерения линейного дихроизма:

/ -- источник света, 2 — монохроматор, 3 — система расщепления светового

луча

на два

взаимно

перпендикулярных линейно поляризованных компонента, 4 — система модуля-

ции,

5 — фокусирующая система, 6 — ориентированный образец, 7 — приемник света.

— система усиления и регистрации фототока

где / (8) — фактор порядка системы, который, являясь функцией

угла

0, изменяется от 1 (при идеальной упорядоченности) до 0 (для

неориентированных образцов) и не зависит от

угла

ср.

Целый ряд экспериментальных измерений и расчетов связан с

регистрацией спектральных зависимостей поляризационных пара-

метров. Зависимости АЛ = А

— A

= / (X); D = A

— f (К); Р — (Аи — A

)I(A\\ + A

) = / (к) представляют собой

спектры линейного дихроизма, дихроичного отношения, степени

дихроизма соответственно.

Разлагая на компоненты спектры поглощения А = / (X) и ве-

личины линейного дихроизма и используя соотношение (Л,, —

— А

)/А, можно вычислить

углы,

отражающие взаимоориентацию

соответствующих моментов переходов различных компонентов, ко-

торые обусловливают наличие определенных полос, составляющих

суммарный спектр поглощения исследуемой системы.

Для регистрации спектров LD обычно применяют

двухлучевые

дифференциальные спектрофотометры, у которых лучи, падающие на

объект, линейно поляризованы в

двух

взаимно перпендикулярных

плоскостях. Таким образом, измерение спектров линейного дихро-

Л A АЛ / (X

изма Л

р р р

АЛ = / (X) в принципе аналогично измере-

нию

разностных спектров поглощения при непосредственной реги-

страции AD = / (к).

Принципиальная

схема

установки для измерения спектров LD

ориентированных образцов показана на рис. 9.

Монохроматическое излучение, полученное после прохождения света

че-

рез оптическую систему спектрофотометра, направляется поворотным

зер-

калом

на

линзу

затем

на

призму Рошона,

помощью которой выделяется

линейно

поляризованная составляющая светового потока. Далее свет

про-

ходит

через призму Волластона, расщепляясь

на два

равных

по

интенсивно-

сти компонента,

но

поляризованные

во

взаимно перпендикулярных плоско-

стях.

При

этом

лучи

света

разной поляризацией разделяются пространствен-

но

модулируются прерывателем

определенной частотой,

затем фоку-

сируются линзой

на

кювету

образцом. Таким образом, через образец

попеременно пропускается свет, поляризованный

горизонтальной

верти-

кальной плоскостях. Прошедший через образец свет направляется

на

фото-

приемник,

затем сигнал усиливается

регистрируется

помощью специаль-

ной

электрической системы.

Для

измерения спектров

LD при

низких

тем-

пературах

кювету

образцом помещают

криостат, заполненный жидким

азотом.

Существуют

другие

схемы дихрографов, основанных

на

таком

же общем принципе регистрации. Кюветные отделения

могут

сущест-

венно

различаться

зависимости

от

способа ориентации образца.

Например,

при

ориентации образцов

магнитном поле разработано

специальное устройство, позволяющее вводить

кюветное отделе-

ние

постоянный магнит

создавать

кюветном отделении необхо-

димую

напряженность поля. Использование образцов, ориентиро-

ванных

полиакриламидном геле,

не

создает никаких дополнитель-

ных трудностей

и не

требует

специальной переделки кюветной

камеры.

Методы

кругового дихроизма и дисперсии

оптического вращения

Хорошо известно,

что

практически

все

синтезируемые биологиче-

скими

системами молекулы оптически активны. Необходимо

пони-

мать, каким образом оптически активная среда изменяет характер

поляризации

действующего

на

нее света

какие параметры

при

этом

измеряются экспериментатором

для

получения информации

свой-

ствах

исследуемого объекта.

При

прохождении света через оптически активную

среду

можно

проводить исследование

кругового

дихроизма

(КД),

эллиптичности

в,

оптического вращения

Ф и

кругового двулучепреломления

(КДП).

Все эти

оптические характеристики взаимосвязаны

дают

информацию

структуре

конформационных свойствах

как

отдель-

ных молекул,

так и

макромолекулярных комплексов.

Для того чтобы понять,

что

представляют собой перечисленные

выше характеристики, необходимо рассмотреть, каким образом

из-

меняются свойства плоскополяризованного света, когда

он

прохо-

дит через оптически активную

среду.

Если представить плоскопо-

ляризованную волну

виде векторной суммы

двух

циркулярно

поляризованных компонентов

одинаковой амплитудой,

но

разли-

чающихся противоположной круговой поляризацией,

то

одна

со-

ставляющая

будет

поляризована

по

кругу

вправо

(R), а

другая

—

влево

(L).

Таким образом,

для

этих волн конец электрического

век-

тора

при их

распространении вдоль направления

описывает

спи-

раль соответственно

левым

или

правым вращением,

а его

проекция

на

плоскость

ху

(перпендикулярную направлению распростране-

ния

света) является кругом

(рис. 10).

Если обозначить через

иЕ„

компоненты электрического

век-

тора

Е, то для

волны

правой круговой поляризацией

= Е

cos

(at—Кг);

= — Е

sin

(v>t

— Kz),

для

волны

левой круговой поляризацией

= Е

cos

(со/—Кг);

= Е

sin

(со/

— Кг),

где аз = 2л v; К — ш/с.

Отсюда очевидно, что при

суммировании этих

двух

волн получается плоскопо-

ляризованная

волна:

cos(wt-Kz);

Рис

10. Мгновенное изображение поляри-

зованной

по

кругу

световой волны

Для наблюдателя, который смотрит навстречу

распространяющейся

вдоль оси 2 волне, конец

электрического вектора вращается против часо-

вой

стрелки (левая поляризация)

В том случае, когда та-

кие

два поляризованных

по

кругу

компонента («пра-

вая»

«левая»

волна) про-

ходят

через оптически ак-

тивную

среду,

они

могут

по-разному поглощаться

(КД),

а также распространяться с разными скоростями

(КДП).

Таким

образом, оптическая среда, имеющая круговое (или цирку-

лярное) двулучепреломление, одновременно обладает и круговым

(или

циркулярным) дихроизмом. Если поглощение света для ком-

понентов с правой (AR) И левой (Л^.) круговой поляризацией раз-

личается, то после прохождения через оптически активную

среду

результирующий электрический вектор Е уже не

будет

лежать в

одной плоскости, а станет описывать эллипс. Это происходит пото-

му, что правая и левая составляющие, хотя и сохраняют свою кру-

говую

поляризацию,

будут

иметь различные амплитуды. При их

сложении конец электрического вектора

будет

двигаться по эллип-

тической винтовой линии вдоль оси распространения, а его проек-

ция

на плоскость, перпенди-

кулярную этой оси,

будет

представлять собой эллипс

(рис.

11). Следовательно, эл-

липтичность в является одной

из

характеристик оптической

активности; она определяется

как

arctg (alb), где а — ма-

лая,

Ъ — большая оси эллип-

са. Если поглощение света

средой очень мало, то соотно-

шение осей эллипса близко к

Рис.

11.

Эллиптически поляризованный

свет

свет выходит

из

образца

(на-

правление распространения перпендику-

лярно

плоскости рисунка); Б-—левая

правая составляющие плоскополяризо-

ванного света, выходящего

из

образца

(при

их

векторном сложении проекция

на

плоскость

ху

даст

эллипс)

нулю (в да 0) и свет можно

считать плоскополяризован-

ным

(на рис. 11 в = ср).

Таким

образом, разница

поглощении левой и правой

циркулярно поляризованных

волн (круговой дихроизм)