Рубин А.Б. Современные методы биофизических исследований (Практикум по биофизике)

Подождите немного. Документ загружается.

же как и для флуоресценции,

существует

понятие

квантового

выхо-

да ф, определяемого как отношение эффекта (например, числа про-

реагировавших молекул) к количеству поглощенных квантов (чис-

лу молекул, поглотивших кванты)

погл

Отсюда

ясно,

что спектр действия можно выразить следующим соот-

ношением:

-£-=

/С

(1-Т)ф

==/<*,),

"О

где Ф — квантовый

выход

фотопроцесса, (1 — Т) — поглощение.

В отличие от флуоресценции величина эффекта для фотобиологиче-

ских процессов не прямо пропорциональна интенсивности действую-

щего света и насыщается при увеличении /

Таким

образом, ф является функцией /

и, как правило, умень-

шается с возрастанием интенсивности действующего света, что соз-

дает

определенные трудности при измерении спектров действия фо-

тобиологических процессов. Однако эти трудности

могут

быть прео-

долены, если применять высокочувствительную технику для реги-

страции исследуемого фотобиологического эффекта и при этом ис-

пользовать ненасыщающие интенсивности света (т. е. линейный

участок зависимости эффективности от /„). Измерив затем величины

эффекта

при разных длинах волн возбуждения, делят получаемые

значения

на интенсивность падающего света (в квантах) при каждой

длине волны и

получают

спектр действия фотопроцесса.

При

другом

способе измерения спектров действия фотобиологи-

ческого процесса выбирают

такую

интенсивность возбуждающего

света, которая индуцирует одинаковый фотобиологический эффект

при

всех

длинах волн. Таким образом, эффективность процесса

будет

обратно пропорциональна интенсивности света /

Существу-

ют установки, позволяющие, например, измерять

спектры

действия

фотосинтеза

по

скорости

выделения

кислорода.

Один из методов

заключается в том, что интенсивность света устанавливается авто-

матически в режиме, когда регистрируемое полярографически коли-

чество выделяющегося кислорода одинаково при

всех

Я,. В этом слу-

чае регистрируется величина, обратная интенсивности падающего

света (1//

), и спектр действия представляет собой зависимость

1//

от длины волны, т. е. 1//

= / (К).

Методы

измерения

квантовых

выходов

флуоресценции

Существуют

методы определения абсолютных и относительных кван-

товых выходов флуоресценции. Измерение

абсолютных

квантовых

выходов

сопряжено с целым рядом трудностей. Поскольку ф =

фл

/л

погл

, необходимо сравнивать число поглощенных квантов

монохроматического света

числом квантов полихроматического

излучения флуоресценции, которое распределяется

пространстве

во всех направлениях.

По

этой причине

при

регистрации флуорес-

ценции

на

детектор попадет лишь некоторая доля светового потока

при

данной длине волны. Таким образом,

для

определения

необ-

ходимо знать абсолютную интенсивность возбуждающего света

/„ и

константу, связанную

конкретным геометрическим расположени-

ем образца

оптических узлов экспериментальной установки, кото-

рая влияет

на

регистрируемую интенсивность флуоресценции

//.

Предложенный впервые

С. И.

Вавиловым прямой метод заклю-

чался

том,

что

сопоставлялась интенсивность флуоресценции,

ис-

пускаемой

передней стенки образца,

интенсивностью возбужда-

ющего света, рассеянного полностью

от

чистой матовой поверхно-

сти.

При

этом учитывали изменения чувствительности приемника

излучения

для

разных длин волн,

образцы помещали

интегри-

рующую

сферу. Позднее принцип этого метода

был

развит

целой

серии работ,

которых флуоресценция

рассеянный возбуждаю-

щий

свет трансформировались

излучение специальным флуорес-

цирующим экраном (например, родамином

В) с

одинаковой

эффек-

тивностью

затем регистрировались детектором.

При

этом вместо

белой матовой поверхности

для

рассеивания возбуждающего света

применяли

разбавленные растворы белка. Недостаток этого метода

заключается

том,

что

раствор белка может

не

обладать идеаль-

ными

рассеивающими свойствами.

Для практических целей обычно используют измерения

не аб-

солютных,

относительных

квантовых

выходов

флуоресценции.

При

этом сравнивают квантовые выходы исследуемых образцов

стан-

дартных веществ

известным значением

ф.

Абсолютные квантовые

выходы флуоресценции многих веществ определены

необходимой

точностью, поэтому

эти

вещества обычно

применяют

качестве

стандартов

для

вычисления значений

ф для

других

соединений.

Из-

мерения проводят

на

обычных спектрофлуорометрах

использова-

нием

низких концентраций исследуемых веществ (разбавленных

растворов,

D <

0,02),

чтобы избежать эффектов экранирования

реабсорбции флуоресценции.

Интенсивность

флуоресценции

(квант/с) пропорциональна

интенсивности возбуждающего света

(квант/с), поглощению

— Т) и

квантовому

выходу

ф; при

малых

D l

2,303

ес/ф.

Тогда если обозначить через

квантовый

выход

стандартного

сое-

динения,

через ц>

—

определяемый квантовый

выход

исследуе-

мого вещества,

то при

измерении относительной интенсивности

флуоресценции опытного

контрольного

образцов

одинако-

вых условиях

(та же

кювета, одинаковое геометрическое располо-

жение)

2,303/

/ф

Ч ^ 1

ес/

При

подборе концентрации таким образом, что е^

получим ф* = (/ JI) ф.

Поскольку полному числу испускаемых квантов / и I

пропор-

циональны

площади под кривыми истинных спектров флуоресцен-

ции,

необходимо экспериментально измеренные спектры флуорес-

ценции,

зарегистрированные при одинаковых условиях, исправить

с учетом спектральной чувствительности установки. Методы расче-

та истинных спектров флуоресценции по экспериментальным кри-

вым были обсуждены в предыдущем разделе.

Таким

образом, определение квантового выхода флуоресценции

исследуемого образца ф

по известному значению ф стандартного

соединения сводится к вычислению соотношения

между

площадями

под кривыми истинных спектров флуоресценции опытного и конт-

рольного образцов. Квантовые выходы стандартных флуоресциру-

ющих веществ в разных растворителях

могут

быть взяты из соответ-

ствующих таблиц. Наиболее высокие значения ф имеют такие сое-

динения,

как флуоресцеин

(0,79—0,92,

в щелочном растворе), пе-

рилен

(0,87—0,98)

и 9,10-дифенилантрацен (0,76—1,0). Хлорофилл

а в эфире (к

= 644 нм) имеет квантовый

выход

около 0,3, а хло-

рофилл Ь в тех же условиях — около 0,1.

При

измерениях квантовых выходов указанными выше способа-

ми

необходимо избегать ошибок вследствие немонохроматичности

возбуждающего света, флуоресценции кювет, эффектов экраниро-

вания

и реабсорбции, фотохимических процессов, тушения кисло-

родом и т. п.

Одним из методов определения квантовых выходов является так-

же метод, основанный на измерении

времени

жизни

(или скорости

затухания флуоресценции). Такой способ измерения ф относится

разряду

динамических

методов,

которые

будут

рассмотрены в по-

следующих разделах. Сейчас необходимо лишь указать, что время

жизни

определяется из экспоненциальной кривой затухания флуо-

ресценции,

возникающей в ответ на импульсное возбуждение иссле-

дуемого

объекта короткой лазерной вспышкой (< 1 не). Определив

время жизни флуоресценции х

}

и зная радиационное время жизни

тя,

которое можно вычислить из спектров поглощения (1/т

2900

n\l

fedv),

рассчитывают квантовый

выход

флуоресцен-

ции:

фу =

Xfftp.

Как

уже обсуждалось ранее, относительный квантовый

выход

для индивидуальных веществ в стоксовой области постоянен при

всех длинах волн. Однако в

случае

сложной системы, когда флуо-

ресцирует только часть поглощающих свет компонентов, квантовый

выход

уже

будет

не постоянным, а зависимым от длины волны воз-

буждающего света. Измерение такой зависимости может дать инфор-

мацию о миграции энергии в многокомпонентной системе. Так, в

простой двухкомпонентной системе (смесь веществ / и //), в которой

флуоресцирует только один компонент //,

выход

флуоресценции ока-

жется пропорциональным доле поглощения вещества // в общем по-

глощении. Очевидно, что квантовый выход чистого вещества //

<система однокомпонентна) не зависит от длины волны возбуждаю-

щего света. Однако в смеси (двухкомпонентная система) при

отсут-

ствии миграции энергии с компонента / на компонент //

квантовый выход флуоресцирующего вещества // (ф//)

будет

па-

дать в области поглощения вещества / (экранирующий

эффект).

случае

полной (100%-ной) миграции энергии с компонента / на

компонент

// квантовый выход <р// окажется постоянным в области

поглощения обоих веществ. Во всех промежуточных ситуациях

•(частичная миграция энергии) ф//

будет

всегда уменьшаться при

переходе в область поглощения компонента /.

10.

Поляризация

флуоресценции

методы

ее

измерения

Измерение

поляризованной (анизотропной) флуоресценции

дает

информацию

о размерах, конформации, внутренней подвижности

макромолекул, о миграции энергии возбуждения

между

различны-

ми

компонентами сложных систем и об ориентации их дипольных

моментов электронных переходов.

При

возбуждении свет поглощается молекулами, которые оказы-

ваются определенным образом ориентированными по отношению к

электрическому вектору световой волны. Поскольку излучение ис-

пускается с наиболее низкого возбужденного электронного уровня

даже в том случае, когда возбуждение происходит на более высокие

энергетические уровни молекулы (более коротковолновые полосы

поглощения в спектре), осцилляторы во флуоресценции и погло-

щении

будут

различаться не только частотой, но и ориентацией

относительно скелета молекулы.

Иными

словами, после поглощения

энергия

излучается в результате

другого

электронного перехода со

своим направлением дипольного перехода.

Только в том случае, когда поглощение происходит на самый

нижний

возбужденный уровень, испускание

будет

представлять со-

бой точное обращение процесса поглощения. Переходный момент

молекулы

будет

находиться в плоскости колебаний испускаемого

света. При этом направление распространения флуоресценции хотя

не обязательно должно быть перпендикулярным моменту перехо-

да, однако является наиболее вероятным. Существенно подчеркнуть,

что если время жизни возбужденного состояния оказывается боль-

шим

по сравнению с временем, необходимым для переориентации

молекулы (т. е. за время возбужденного состояния ориентация

молекул или хромофоров становится хаотической), то флуоресцен-

ция

будет

полностью деполяризована.

Однако в реальных случаях для большинства макромолекул

переориентация происходит не так быстро и за время жизни воз-

бужденного состояния ориентация не успевает стать хаотической.

Более того, в некоторых случаях молекулы

могут

оказаться доста-

точно жестко фиксированными и даже ориентированными одинако-

Рис.

17. Поляризация флуоресценции

Возбуждающий

свет

плоскополяриэован

распространяется

вдоль

оси Ох;

свет-

флуоресценции

распространяется

вдоль

оси Оу

(остальные

объяснения

см. в

тексте)

вым образом, подобно полимер-

ным

молекулам в пленках.

При

исследовании флуорес-

ценции

растворов сложных орга-

нических

молекул (красителей)

обнаружено, что излучение

всегда частично поляризовано,

хотя в таких системах молекулы

флуоресцирующего вещества

распределены в среде хаотиче-

ски.

Анизотропия в распределе-

нии

излучающих молекул в этом

случае

создается самим возбуж-

дающим светом, поскольку ве-

роятность возбуждения молеку-

лы определяется

углом

между

осью осциллятора (моментом пе-

рехода)

поглощения и направлением электрического вектора падаю-

щего на объект света.

Амплитуду

электрического вектора Е мо-

жно

разложить на две взаимно перпендикулярные составляющие:

параллельную и перпендикулярную оси осциллятора молекулы.

Очевидно, что действующая амплитуда окажется

тогда

равной

Е cos 9, а интенсивность — Е

cos*9. Таким образом, вероятность

поглощения

для данной ориентации, определяемой

углом

9, ока-

жется пропорциональной cos

9. Это означает, что главным образом

будут

возбуждаться те молекулы, момент перехода которых парал-

лелен вектору Е (рис. 17).

Рассмотрим вначале

жесткую

изотропную

систему,

когда флуо-

ресцирующие молекулы или хромофоры расположены хаотически

за характерные времена флуоресценции переориентация моле-

кул не происходит. Такими системами

могут

быть, например, замо-

роженные растворы молекул или жестко связанные с относительно

большими молекулами хромофоры. Пусть излучению и поглоще-

нию

соответствует один и тот же электронный переход в молекуле

-*- SI, S\

-*•

+ hv),

тогда

угол

между

моментами перехо-

дов поглощения и излучения равен нулю (а = 0, моменты перехо-

дов параллельны). Если такую систему освещать плоскополяризо-

ванным

светом, распространяющимся вдоль оси Ох, электрический

вектор которого лежит в плоскости (рис. 17) хОг, то флуоресценция,

распространяющаяся

вдоль оси Оу,

будет

поляризована вследствие

анизотропии

распределения возбужденных молекул (вероятность

пропорциональна

cos

с цилиндрической симметрией относитель-

но

оси z.

Поскольку

анизотропия возбужденных молекул в течение всего

времени

возбужденного состояния сохраняется (жесткая система),

испускаемая флуоресценция также анизотропна и можно опреде-

лить

степень

поляризации

флуоресценции

Р.

Если измерять интенсивность флуоресценции, излучаемую по

оси у, то компонент F

, поляризованный параллельно поляриза-

ции

возбуждающего света (вдоль оси z),

будет

больше компонента

с перпендикулярной поляризацией (вдоль оси ж) F

. Отсюда

следует,

что степень поляризации Р удобно представить как разницу (F

—

— F

), деленную на

сумму

+ F

), т. е. Р = (F

— FJi

/(F,,

+ F

). Можно показать, что суммарный полный свет флуо-

ресценции

пропорционален (F

+ 2F

), т. е. суммарное излучение

содержит вдвое больше перпендикулярных составляющих, поэто-

му разницу (F

— F

) можно нормировать и на величину (F

). Такое соотношение называется

степенью

анизотропии

{А): А = (F

— FjJ (F

+ 2F

). Величину А часто исполь-

зуют

при анализе поляризационных характеристик сложных систем.

Иногда для оценки ориентации дипольных моментов переходов при-

меняют так называемое

поляризационное

отношение

PF —

Степени поляризации и анизотропии флуоресценции связаны

друг

другом

следующими соотношениями: Р =

3/4/(2

+ А);

= 2Р/(3 — Р).

Для вычисления компонентов F

и F

поляризованной флуо-

ресценции

для описанной выше системы (рис. 17) необходимо умно-

жить вероятность излучения W] на долю возбужденных молекул с

заданной ориентацией дипольных моментов переходов gA и произ-

вести усреднение по всем ориентациям (углам 0 и ф). Относительное

число молекул с ц, ориентированным в интервале

углов

d6 и dq>

до возбуждения, пропорционально sin 8d6d<p, где множитель sin fl

отражает большую вероятность встретить молекулы с преимуще-

ственно перпендикулярной ориентацией по отношению к ориента-

ции

электрического вектора Е, параллельного оси г. С другой сто-

роны,

вероятность возбуждения ориентированной молекулы про-

порциональна cos

0. Таким образом, относительное количество воз-

бужденных молекул

будет

пропорционально К = sin 0 cos

0d0d(p.

Общее число возбужденных молекул

будет

равно

In л

f d(p f sin0cos*0de,

тогда

как относительное число ориентированных в интервале

углов

d 0 и d<j> возбужденных молекул есть К (0, ф).

Отсюда доля возбужденных молекул с заданной ориентацией вы-

разится соотношением

(0,

Ф)

= *

ф)

= — л sin 0 cos

0d0dф.

2л 'л 4

dq>

J" sin

cos

6d6

Вероятность испускания компонента поляризованной флуорес-

ценции

с параллельной электрическому вектору возбуждающего

света (оси г) ориентацией момента перехода W

\\ пропорциональна

cos

0, в то время как для компонента с перпендикулярной

ориентацией W

— пропорциональна

sin

cos

q>, поскольку ве-

роятности определяются величинами

|ц^

или

\цК

где К

Кх — единичные векторы вдоль оси г и х соответственно. Относи-

тельные интенсивности компонентов поляризованной флуоресцен-

ции

и F

, очевидно,

будут

равны F

fll

(9) g

(6, ф)

f i = W

(0, ф) g

(9, ф), откуда

= — л sin 9 cos

в cos

0d0df

= — л sin 9 cos

9d0dф;

Л51п9со5

8{п

0со8

фс10^ф

nsin

—Л51п9со5

8{п

0со8

фс10(^ф = —nsin

9 X

4 4

X cos

9 cos

ф(19с1ф.

После интегрирования по всем

углам

9 и ф

2Л

=— л

in9cos

9d9

dф=-

—

;

Л 2л

= — л Г sin

0 cos

9d0 Г cos

фdф = — •

Таким

образом, при возбуждении поляризованным вдоль оси

2 возбуждающим светом (Е параллельно оси z) жесткой системы с

хаотической ориентацией осцилляторов в условиях, когда направле-

ния

моментов переходов поглощения и излучения совпадают, ис-

пускается частично поляризованная флуоресценция и степень по-

ляризации

оказывается равной 1/2. Это значение степени поляриза-

ции

называется

предельным,

поскольку оно получено для жест-

кой

среды, когда поворот молекулы за характерное время жизни

флуоресценции невозможен. Предельное значение степени анизо-

тропии для рассмотренной ситуации легко вычислить, воспользо-

вавшись соотношением А = 2Р /(3 — Р) = 2/5. Предельные

значения

степени поляризации и анизотропии, обозначаемые часто

как

и А

соответственно, зависят от

угла

между

моментами

перехода поглощения и флуоресценции. Для вертикально поляри-

зованного возбуждающего света

= (3cos

cc— l)/(cos

a + 3) и A, = (3cos

a— l)/5.

Отсюда

следует,

что если

угол

между

осцилляторами составля-

ет л/2, то Р

= — 1/3 и А

= — 1/5. Такие ситуации часто ре-

ализуются для плоских хромофоров, когда при поглощении моле-

кула переходит на второй (энергетически более высокий) возбуж-

денный уровень SJ с последующим излучением с первого возбуж-

денного уровня St. Из рис. 18 видно, что предельные значения сте-

пени

поляризации возрастают от

—0,33

до + 0,5 при изменении

а от л/2 до 0. В более общем

случае

угол

будет

иметь различные

значения

для разных электронных переходов и, следовательно,

зависит от к возбуждающего света.

Такие поляризационные спектры в принципе позволяют разре-

шить перекрывающиеся полосы, соответствующие различным элект-

ронным

переходам. Уравнение, описывающее взаимосвязь Р

и а,

дает

возможность определить ориентацию осцилляторов различных

полос поглощения по отношению к флуоресцирующему осциллято-

ру. Однако в реальных ситуациях поляризационные спектры флуо-

ресценции

достаточно сложны не только из-за перекрывания не-

скольких полос поглощения, но и потому, что в

случае

даже

про-

стых

переходов с основного уровня на первый синглетный и обрат-

но

величина Р

может варьировать для разных компонентов коле-

бательной

структуры

полосы флуоресценции. Это означает, что по-

ляризация

флуоресценции при неизменной длине волны

возбужде-

ния

может зависеть от длины волны самой флуоресценции.

Представленные выше соотношения для определения предель-

ных значений степени поляризации и анизотропии были выведены

для случая, когда флуоресценция возбуждалась линейно поляри-

зованным светом. Однако флуоресценция оказывается частично поля-

ризованной

и в том случае, если возбуждение производится естест-

венным (неполяризованным) светом. При этом анизотропия флуо-

ресцирующих молекул создается падающим светом, который

будет

преимущественно

возбуждать

те молекулы, моменты переходов ко-

торых расположены под небольшим

углом

к плоскости, перпенди-

кулярной к направлению распространения возбуждающего света

(плоскость zOy; см. рис. 17). Предельная степень поляризации при

возбуждении естественным светом Р

связана с предельным значе-

нием

поляризации при возбуждении поляризованным светом соот-

ношением

= Р

/(2-Р

Если измеряемые образцы имеют

слабую

флуоресценцию, которая,

однако,

сильно поляризована, то использование естественного све-

та при возбуждении имеет большой практический смысл, поскольку

позволяет существенно (более чем в два раза) увеличить интенсив-

ность возбуждения и флуоресценции.

случае

возбуждения естественным светом неподвижных неори-

ентированных молекул предельная степень поляризации также свя-

зана с

углом

между

моментами перехода поглощающих и флуорес-

цирующих диполей:

—cos

a).

При

изменении а от 0 до я/2 величина Р

варьирует в пределах от

1/3 до —1/7 (рис. 19). Если a = 55°, то Р

= Р

= 0, т. е.

= F

. Предельные значения степени поляризации, которые

вычислены из предположения о полной анизотропии осцилляторов

A.F

-0.33

—

Рис.

18. Спектры поглощения (Л),

флуоресценции (F) и возбуждения

поляризации флуоресценции (Ро) ги-

потетического вещества с двумя вза-

имно перпендикулярно ориентирован-

ными

полосами поглощения

-0,3-

Рис.

19. Зависимость предельных зна-

чений степени поляризации флуорес-

ценции при возбуждении вертикально

поляризованным (Ро) и неполяризо-

ванным

(Р

) светом от угла а меж-

ду

поглощающим и флуоресцирую-

щим осцилляторами

жесткой фиксации молекул

среде, практически никогда

не

наблюдаются. Например, вместо величины

= 0,5 (а = 0,

возбу-

ждение плоскополяризованным светом) регистрируемое значение

лежит

пределах

0,40—0,45.

Такие различия

между

теоретической

экспериментально определяемой величиной

связаны

неполной

анизотропией самых осцилляторов поглощения

флуоресценции

их нежесткой фиксацией относительно скелета молекулы. Предель-

ное значение степени поляризации может быть использовано

для по-

лучения информации

симметрии молекулы.

Как

было показано выше,

достигает значения

условиях

полной

анизотропии осцилляторов, которые совпадают

по

направ-

лению. Однако подобная модельная система оказывается примени-

мой только

случаю, когда молекулы

обладают

достаточно низкой

симметрией. Если рассмотреть молекулы

плоским строением,

ко-

торые

обладают

высокой симметрией (например, молекула бензола),

то оказывается невозможным выделить преимущественное направ-

ление осцилляторов поглощения

или

испускания,

необходимо

учесть

сразу несколько равновероятных направлений

для

осцилля-

тора

плоскости молекулы. Процессы поглощения

испускания

данной ситуации необходимо моделировать

уже так

называемым

«плоским осциллятором», который

будет

характеризоваться состав-

ляющими,

расположенными

плоскости молекулы

имеющими

одинаковую величину

разное направление.

При

этом перпендику-

лярная

плоскости молекулы составляющая

первом приближении

оказывается равной нулю (плоские осцилляторы характеризуют

молекулы

вырожденными электронными состояниями).

соот-

ветствии

теоретическими расчетами предельное значение степени

поляризации

у высокосимметричных молекул оказывается сущест-

венно

меньше, чем у несимметричных. Показано, что если молеку-

ла имеет симметрию выше второго порядка (п > 2), то степень по-

ляризации

R < 1/7 (случай плоского осциллятора); если п < 2

(симметрия второго порядка или ниже), то Р < 1/2.

помощью метода измерения степени поляризации исследована

симметрия молекул порфиринов. Оказалось, что Р не остается по-

стоянной

в спектре флуоресценции, а изменяется довольно значи-

тельно при

переходе

от одной полосы флуоресценции к другой. Пре-

дельное значение для тетрафенилпорфина в этих экспериментах со-

ставило около 0,4. Это означает, что симметрия такой молекулы не

выше второго порядка.

Аналогичные

результаты

удалось

получить и для молекул про-

зопорфина

и мезопорфина. Для фталоцианина магния предельное

значение степени поляризации не превышало 1/7. Эти данные по-

зволили прийти к

выводу,

что молекула фталоцианина магния име-

ет симметрию четвертого порядка и четыре пиррольных кольца, оп-

ределяющие

структуру

молекулы, полностью эквивалентны, а сим-

метрично расположенные химические связи равноправны. Теорети-

ческое значение Р

=•

1/7

будет

получаться, если осцилляторы по-

глощения и флуоресценции расположены в плоскости молекулы.

Действительно, длинноволновый осциллятор поглощения у молекул

указанного выше типа лежит в плоскости молекулы.

При

изучении дихроизма пленок хлорофилла также оказалось,

что момент перехода длинноволновой (красной) полосы поглощения

расположен в плоскости молекулы. Однако значение степени поля-

ризации

составляло около 0,42, что характерно для несимметричных

молекул. По всей вероятности, симметрия у хлорофилла по срав-

нению

с фталоцианином магния частично нарушается вследствие

гидрирования одного из пиррольных колец.

Изучение спектра поляризованной флуоресценции, т. е. зависи-

мости степени поляризации от длины волны флуоресценции Р —

/(^Фл),

позволяет исследовать природу полос излучения мо-

лекулы и влияние колебаний на поляризационные свойства. Для

порфиринов,

например, величина Р зависела от длины волны флу-

оресценции,

причем в коротковолновой полосе степень поляризации

составляла около 0,40 (значение характерно для сложных молекул

вязкой среде),

тогда

как в длинноволновой полосе — около 0,15.

В данном

случае

каждой полосе флуоресценции соответствовала

своя величина Р.

Для сложных молекул с одной полосой испускания величина Р

монотонно

изменяется в пределах полосы испускания (приблизи-

тельно на 5—10 %). Это означает, что для порфиринов (например,

для тетрафенилпорфина или протопорфирина) зависимость Р =

- /

(А.

фл

)

отличается от аналогичной зависимости у сложных моле-

кул. Изучение зависимости степени поляризации от длины волны

возбуждающего света Р = /(Я

) (спектра возбуждения поляризован-