Рубин А.Б. Современные методы биофизических исследований (Практикум по биофизике)

Подождите немного. Документ загружается.

вие с окружающими магнитными полями может увеличиваться, что

уменьшает магнитное сопряжение электронной пары с антипарал-

лельными спинами.

Молекула в триплетном состоянии может обладать высокой ре-

акционной

способностью, поскольку она пребывает в этом состоя-

нии

достаточно

долгое

время (порядка миллисекунд и больше). С

другой

стороны, в триплетном состоянии распределение электро-

на

происходит в большем объеме, чем в ее синглетном состоянии.

По

этим причинам в триплетном состоянии у молекулы возрастает

вероятность обмена электроном с ближайшим окружением.

Молекулы в триплетном состоянии особенно эффективно дезак-

тивируются растворенными молекулами, которые

обладают

неспа-

ренными

электронами, в частности молекулами кислорода. Эти ве-

щества

(«тушители»)

могут

взаимодействовать с триплетными мо-

лекулами, находясь

даже

в ничтожных концентрациях.

Важную

роль в фотохимии сложных многоатомных молекул стали приписы-

вать триплетным состояниям после обнаружения миграции энер-

гии возбуждения по триплетным уровням. Вначале в

твердых

раст-

ворах, а затем и в жидких было обнаружено, что молекула донора

(сенсибилизатора), находясь в своем нижнем триплетном состоянии,

может при соответствующих условиях передавать энергию

возбуж-

дения

другой

молекуле (акцептору, тушителю), которая находится

основном синглетном состоянии. При этом молекула донора пере-

ходит

в основное синглетное состояние (безызлучательно), а моле-

кула акцептора становится триплетной. Существенно, что в соот-

ветствии с правилом Вигнера суммарный спиновый момент системы

целом сохраняется:

D(T

)+A(S

)^D(,S

)-\-A(T

где D и А —донор и акцептор соответственно. Необходимо при

этом,

чтобы триплетныи уровень молекулы акцептора был располо-

жен ниже триплетного уровня молекулы донора.

Квантовый

выход

сенсибилизированной фосфоресценции

фф

ОС

для донорно-акцепторных пар определяется соотношением

ффосф

ффосф/(ффосф—ффосф),

где

Ффосф

Ффосф — квантовые интенсивности фосфоресцен-

ции

молекул акцептора и донора, ф£

ОС

ф — квантовая интенсив-

ность донора в

отсутствие

акцептора. Установлено, что эффективное

расстояние /?

переноса в

твердых

растворах (77 К) целого ряда до-

норно-акцепторных пар (бензофенон—нафталин, бензофенон — ки-

налин,

ксантон — нафталин и т. п.) составляет около 1,1 — 1,5 нм,

что на порядок больше, чем R

, рассчитанное из уравнения Фёрсте-

ра, которое для пары бензофенон — нафталин составляло около

0,1 нм. Триплет-триплетный перенос энергии доказан и для жидких

растворов. Механизм такого переноса в принципе аналогичен миг-

рации

энергии по триплетным уровням в

твердых

растворах.

Перенос

энергии по триплетным уровням

дает

возможность ис-

пользовать этот процесс для инициирования фотохимических реак-

ций

молекул, которые не имеют поглощения в спектральной облас-

ти,

подходящей для данных условий эксперимента. Кроме того, с

помощью такой миграции энергии оказывается возможным заселять

триплетные уровни молекул, которые достаточно

трудно

заселить

при

прямом поглощении света из-за того, что лишь небольшой про-

цент

возбужденных синглетных состояний переходит в этом

случае

триплетные состояния.

При

исследовании растворов фотосинтетических пигментов

(хлорофиллов аи Ь) была обнаружена их способность фосфоресциро-

вать. Так, при возбуждении эфирных растворов хлорофилла а око-

ло 67 % молекул

могут

переходить в триплетное состояние. Фосфо-

ресценция

была обнаружена также и в нативных фотосинтетиче-

ских системах при — 196° С (листьях, хлоропластах, клетках

неко-

торых водорослей). Однако in

vivo

фосфоресценция триплетных со-

стояний

хлорофилла обычно эффективно тушится, по-видимому, за

счет

триплет-триплетного переноса энергии от хлорофилла на каро-

тиноиды.

Возникновение фосфоресценции

будет

зависеть не только

от температурных условий, но во многом определяется состоянием

вещества (например, его агрегацией или фиксацией в жесткой мат-

рице),

его молекулярным окружением, а также миграционными эф-

фектами.

Отсюда

следует,

что измерение фосфоресценции может

служить весьма эффективным методом для получения информации о

состоянии

различных компонентов, их реакционной способности,

механизмах миграции энергии возбуждения и т. п.

Для измерения фосфоресценции применяют в принципе те же

приборы,

что и для регистрации обычной (быстрой) флуоресценции.

Однако

при этом необходимо отделить по времени

быструю

флуорес-

ценцию

от фосфоресценции или замедленной флуоресценции. Это до-

стигается с помощью специальных устройств —

фосфороскопов,

позволяющих разделить во времени моменты возбуждения и измере-

ния

излучения. В фосфороскопах используются либо вращающиеся

диски

с секторами или прорезями, либо вращающийся цилиндр со

щелями.

В последнем

случае

цилиндр вращается относительно

двух

других

неподвижных цилиндров, которые также снабжены проре-

зями.

Существуют

также фосфороскопы, в которых одновременно ис-

пользуются и вращающиеся диски, и вращающиеся цилиндры.

В большинстве этих приборов из-за необходимости механической

связи

между

прерывателями на возбуждении и регистрации имеются

ограничения

в геометрии прибора и размере кюветного отделения.

С.

Паркер в начале 60-х годов предложил прибор, который был ли-

шен

указанных выше ограничений и легко мог быть использован и

как

спектрофосфорометр и как спектрофлуорометр. В этой установ-

V-o-®

Рис.

25. Схема установки для измерений фосфоресценции и быстрой флуо-

ресценции:

/ источник света. 2. S возбуждающий н регистрирующий монохроматоры. 3, 7 дис-

ки

прерывателей, вращающихся синхронными моторами, 4 -• пластинка, разделяющая

луч света, 5, 9 - управляющий и регистрирующий фотоумножители.

6—кювета

с об-

разцом в

сосуде

Дьюара

ке

(рис. 25) были использованы два диска, вращаемые отдельными

синхронными

моторами. Оба мотора обеспечивают постоянный сдвиг

по

фазе

между

двумя дисками, поскольку питаются от одного источ-

ника

переменного тока (с частотой 50 Гц). Можно установить пре-

рыватели в фазе или противофазе, не останавливая их, за счет по-

ворота корпуса одного из моторов вокруг оси вращения. Это

дает

возможность последовательно регистрировать долгоживущее излу-

чение,

а также сумму этого излучения и быстрой флуоресценции.

Спектрофлуорометр с помощью этого приспособления легко преоб-

разовать в спектрофосфорометр, установив один прерыватель после

выходной щели монохроматора возбуждения, а другой — перед

вход-

ной

щелью регистрирующего монохроматора. Если диски вращают-

ся

в фазе, то при таком расположении прибор можно использовать

как

спектрофлуорометр.

Использование

поляризационных светофильтров, принцип рас-

положения

которых изложен при описании схемы измерения поля-

ризованной

флуоресценции, позволяет на флуорометре с фосфоро-

скопической

приставкой производить регистрацию и поляризован-

ной

фосфоресценции. Квантовые выходы фосфоресценции можно оп-

ределить. воспользовавшись теми же методами, что и при измере-

нии

квантовых выходов быстрой флуоресценции, которые были опи-

саны выше. С

учетом

коэффициента фосфорометра исправляют запи-

санный

спектр фосфоресценции. Затем сопоставляют площади под

исправленным спектром фосфоресценции с площадью под исправ-

ленным спектром быстрой флуоресценции стандартного вещества

с известным квантовым выходом.

Таким

же способом определяют и квантовый

выход

замедленной

флуоресценции

<р

.ф

Однако в этом случае, если исследуемое

вещество

обладает

также и быстрой флуоресценцией, квантовый вы-

ход которой определен заранее обычным способом,

Ф^.Ц,,, МОЖНО

определить без использования стандартного вещества. Поскольку

спектры замедленной и быстрой флуоресценции должны совпадать

но

форме и положению полос, отношение <р,,.ф

/(рф

легко вычислить

из

отношения интенсивностей главных максимумов в соответствую-

щих спектрах (для этих

двух

типов флуоресценции).

Глава

Динамические спектральные методы

исследования биологических систем

В предыдущем разделе изложены разнообразные спектральные ме-

тоды, которые

могут

быть использованы при изучении главным об-

разом стационарных свойств биологических систем. Однако сама

физическая

сущность и практика применения таких спектральных

методов указывает на то, что эти методы в принципе

могут

дать

информацию

и о

динамических

свойствах

биологических

систем,

т.е.

тех параметрах, которые

будут

изменяться в системе вследствие

протекающих в ней процессов (непосредственно в

ходе

эксперимен-

та).

Такие изменения спектральных параметров, т. е. их динамика,

связаны,

как правило, с превращениями различных компонентов в

сложной биологической системе при протекании реакций, с мигра-

цией

энергии и ее захватом фотоактивными центрами, с переходом

компонентов из одного состояния в другое, например, в результате

конформационных

перестроек, окислительно-восстановительных

процессов, агрегации, дезагрегации, латеральной подвижности

макромолекул и взаимодействия с другими компонентами биомем-

бран,

фосфорилирования белков и т. п. Подобного рода превраще-

ния

могут

происходить за разные времена, охватывая широкий

диапазон — от нескольких пикосекунд до минут, а иногда и часов.

Динамические спектральные методы

дают

возможность непосредст-

венно

следить за кинетикой процессов, происходящих в биологиче-

ской

системе.

Особое значение динамические спектральные методы имеют при

изучении различных фотобиологических процессов в тех случаях,

когда при действии возбуждающего света в системе происходят бы-

строе перераспределение энергии, ее утилизация фотохимически

активными молекулами

последующее превращение редокс-ком-

понентов.

Именно такая последовательность событий характерна

для первичных процессов фотосинтеза, поэтому,

как

показали

экс-

периментальные исследования, динамические спектральные методы

оказались незаменимым инструментом познания механизма утили-

зации

солнечной энергии. Существенно подчеркнуть,

что

сама

спе-

цифика

биологического объекта

развивающихся

в нем

процессов

потребовала

не

только модификации ранее известных динамических

спектральных методов (например, дифференциальной абсорбцион-

ной

флуоресцентной спектроскопии),

но и

создания новых мето-

дик, например таких,

как

пикосекундная абсорбционная

флуорес-

центная

спектроскопия, динамическая поляризационная спектро-

скопия

(измерение фотоиндуцированных спектров линейного

кругового дихроизма, фотоселекция, измерение поляризации

ком-

понентов быстрой

замедленной флуоресценции)

и т. п.

1. Общие

принципы

дифференциальной абсорбционной

спектрофотометрии

В большинстве

случаев

информация

фотобиологических процес-

сах может быть получена

при

измерении изменений спектра погло-

щения

под

влиянием каких-либо воздействий, например света,

электрического поля, добавления

систему компонентов, изменяю-

щих редокс-потенциал среды

и т. п.

Экспериментальные данные,

по-

лученные

при

регистрации таких индуцированных внешним

воз-

действием абсорбционных спектров (дифференциальных спектров),

сочетании

данными обычной стационарной спектрофотометрии

позволяют

судить

о тех

компонентах сложных биологических систем,

которые претерпевают превращения

ходе

разнообразных фотобио-

логических реакций.

Применяемые

для

регистрации абсорбционных изменений

диф-

ференциальные спектрофотометры

по

принципу конструкции можно

разделить

на

несколько типов.

1. Приборы,

которых используется модулированный измеряю-

щий

свет

оптическая компенсация.

первому

типу

таких прибо-

ров относится спектрофотометр

расщеплением измеряющего света

(двухлучевая

схема), который попадает

на

кюветы

контрольным

опытным образцами.

При

этом интенсивность измеряющего

луча

должна быть относительно невелика, чтобы

не

вызвать значитель-

ных фотохимических изменений, сравнимых

регистрируемыми

при

дополнительных воздействиях

на

объект (освещении, добавлении

ре-

агентов

т.п.). Кювета

исследуемым образцом

при

изучении фото-

индуцированных изменений поглощения освещается немодулиро-

ванным

относительно интенсивным действующим (актиничным)

све-

том. Детектирующая

записывающая система устроена таким

об-

разом,

что

реагирует

лишь

на

сигнал

при

изменении поглощения

образца. Перед фотоумножителем помещается светофильтр, позво-

ляющий уменьшить нежелательные эффекты вследствие рассеяния

действующего света.

Второй

тип приборов основан на так называемом двухволновом

принципе,

когда измеряющий луч света (длина волны X,) и луч

сравнения

(длина волны ^

) попеременно проходят через одну и ту

же кювету с образцом. В лаборатории Л. Н. М. Дейзенса был

скон-

струирован спектрофотометр, основанный одновременно на

двух-

волновом и

двухлучевом

принципе. В этом приборе было использо-

вано расщепление

двух

отличающихся по длине волны монохрома-

тических пучков света и, таким образом, на кювету с образцами

(опытным и контрольным) попадали по два

луча

разной длины вол-

ны.

Эта установка позволяет не только одновременно определять

изменение поглощения при

двух

различных длинах волн, но может

быть использована и как обычный двухволновый спектрофотометр.

2. В описанных выше приборах измеряющий луч модулируется

механически, поэтому временное разрешение оказывается не лучше

чем несколько миллисекунд. Для повышения временного раз-

решения

обычно применяется либо немодулированный свет, либо

свет, модулированный с очень высокой частотой. Недостаток пер-

вого способа при регистрации быстрых абсорбционных изменений за-

ключается в том, что на фотоумножитель попадают также действую-

щий

свет и возбуждаемая им флуоресценция объекта. Таким обра-

зом,

для надежной регистрации изменений поглощения необходимо

устранить влияние флуоресценции и действующего света на изме-

ряемый сигнал.

3. Ряд исследователей фотосинтеза в своих работах использо-

вали дифференциальные спектрофотометры, в которых была приме-

нена

модуляция действующего света с различной частотой. Были

вычислены так называемые времена релаксации абсорбционных изме-

нений

интермедиатов (например, пигмента реакционного центра пер-

вой фотосистемы фотосинтеза высших растений

700

В спектрофото-

метрах, используемых в работах Б.

Кока,

между

образцом и фотоум-

ножителем помещали прерыватель, так что действующий свет не

попадал на фотоумножитель. Такая схема позволила проводить из-

мерения при одинаковой длине волны действующего и измеряюще-

го света и уменьшить артефакты за счет флуоресценции образца.

Во всех вышеупомянутых конструкциях дифференциальных

спектрофотометров существенна

геометрия

лучей

действующего

измеряющего

света

(рис. 26).

Наиболее простая система разделения измеряющего и действую-

щего лучей представлена на

схеме

А, однако при

других

вариациях

(Б, В) освобождается большее пространство для расположения фо-

тоумножителя в конструируемой установке. Преимущество систе-

мы разделения по схемам Г и Д заключается в том, что в этих слу-

чаях легче определить интенсивность действующего света в образце

количество (сумму) поглощенной световой энергии. Наибольшую

интенсивность действующего света можно получить, используя схе-

•1

Рис.

26.

Расположение действующего

(7) и

измеряющего

(2)

лучей

относи-

тельно кюветы

образцом

абсорбционном дифференциальном спектрофото-

метре (остальные объяснения

см. в

тексте)

му Д. Взаимоориентация

лучей

по

схеме

Е менее желательна, по-

скольку в спектральной области, где происходит сильное поглоще-

ние,

значительная доля света может не достигать той части образца,

через которую проходит измеряющий луч. Подобное явление мо-

жет приводить к серьезным искажениям спектра действия.

При

измерении дифференциальных спектров, характеризующих

небольшие или (и) быстрые изменения поглощения, необходимо стре-

миться к увеличению отношения полезного сигнала к

шуму,

что

достигается повторением операций (например, светового воздейст-

вия

после темнового интервала), усреднением и накоплением сиг-

налов с помощью компьютерной техники.

2. Метод однолучевой дифференциальной абсорбционной

спектроскопии

Биологические объекты сильно рассеивают свет и

могут

иметь боль-

шую оптическую плотность (например, листья растений, клетки

водорослей), что значительно снижает интенсивность света, попадаю-

щего на приемник излучения (фотоэлемент, фотоумножитель), и за-

трудняет регистрацию абсорбционных изменений. Использование

однолучевых дифференциальных спектрофотометров позволяет по-

высить интенсивность источника света и добиться увеличения чув-

ствительности при регистрации изменений оптической плотности

(AD) вплоть до 10~

D. Однако в большинстве

случаев

эта возмож-

ность реализуется лишь при измерении достаточно быстрых про-

цессов, протекающих за времена менее 1 с, поскольку при регистра-

ции

более медленных процессов по однолучевой

схеме

чувствитель-

ность уменьшается вследствие недостаточной стабильности отдель-

ных узлов установки, что приводит к дрейфу нулевой линии и необ-

ходимости учитывать влияния внешних наводок на детектируемый

сигнал.

Применение

однолучевых дифференциальных спектрофотомет-

ров сопряжено со значительными сложностями также в тех слу-

чаях, когда небольшие индуцированные изменения в оптической

плотности сопровождаются неспецифическими изменениями в свето-

рассеянии.

Основной

принцип

метода

однолучевой

дифференциаль-

ной

спектроскопии

состоит в том, что образец в кювете зондируется

слабым монохроматическим измеряющим светом, который, проходя

через объект, фиксируется приемником. Возникающий фототок, про-

порциональный

интенсивности прошедшего через образец света,

компенсируется от вспомогательного источника противоположно на-

правленным и равным величине фототока электрическим сигналом

). При освещении образца действующим светом (более высокой ин-

тенсивности по сравнению с измеряющим светом) или при добавле-

нии

к образцу каких-либо реагентов, а также при

других

возмож-

ных внешних воздействиях возникает индуцированный дифферен-

циальный сигнал (Ai" -- i — /„) вследствие изменения поглощения

(пропускания),

который регистрируется приемником. Варьируя

длину волны зондирующего монохроматического света, можно про-

водить измерение кинетики изменений поглощения при разных >..

а затем, если эта кинетика определяется, например, одним из ком-

понентов исследуемой системы, нетрудно получить спектр измене-

ний

поглощения этого компонента Д/ ~ ДО

/ (К).

Следует

иметь в

виду,

что. хотя однолучевой метод позволяет до-

стичь максимальной чувствительности порядка 10~

D, реальная

чувствительность обычных однолучевых дифференциальных спект-

рофотометров из-за относительной нестабильности оптических, ме-

ханических и электрических узлов оказывается значительно мень-

ше и величина надежно регистрируемых изменений поглощения

не

превышает 10~

случае

фотобиологических исследований особенно важно ис-

ключить попадание интенсивного действующего света на фотопри-

емник,

что достигается применением светофильтров (или монохро-

матора). расположенных после объекта, которые пропускают изме-

ряющий свет и не пропускают рассеянный действующий свет. Та-

кой

метод существенно ограничивает спектральный диапазон изме-

рений.

Этот недостаток может быть в значительной мере устранен,

если использовать модуляцию измеряющего света и регистрирую-

щую систему, чувствительную к частоте и фазе измеряемого

сигнала.

Однако

существует

более простое решение проблемы, заключаю-

щееся в том, что момент светового воздействия и измерения разде-

ляются во времени с помощью фосфороскопического устройства.

Такой

метод был впервые использован в работах Б.

Кока,

Н. В. Ка-

19 20

Рис.

27.

Схема однолучевого дифференциального спектрофотометра:

14 — источники измеряющего и действующего света, 2, 4, 8, 10, 13 — фокусирующие

линзы, 3. 15 — монохронаторы, 5 — кювета с образцом, 6, 9 — фотозатворы; 7 —

фосфоро-

скоп,

//, 16 — светофильтры, 12 — тепловой фильтр. 17 — фотоумножитель, /« — компен-

сирующее устройство, 19 — усилитель постоянного тока. 20 — самопишущий потенциометр

рапетяна

сотрудников кафедры биофизики Биологического

фа-

культета

МГУ. На рис. 27

приведена схема установки

для

изме-

рения

кинетики

спектров фотоиндуцированных изменений погло-

щения.

Исследуемый образец помещают

кювету, расположенную

во

внутрен-

нем

неподвижном стакане фосфороскопического устройства (модулятора).

Это устройство состоит

из

трех

коаксиальных цилиндров

прорезями (окна-

ми).

Внутренний

внешний стаканы неподвижны

имеют четыре окна,

рас-

положенные через

90°;

средний стакан вращается (модулятор)

содержит

два

окна

через

180 . При

вращении среднего стакана образец попеременно осве-

щается действующим

измеряющим светом. Такое устройство позволяет

изо-

лировать фотоумножитель

от

прямого попадания

на

него интенсивного

дей-

ствующего

света,

также

от

возбуждаемой этим светом флуоресценции

объ-

екта, поскольку

ее

время жизни

на

несколько порядков меньше времени

тем-

нового интервала

между

моментами воздействия

измерения. Таким обра-

зом,

момент освещения объекта действующим светом путь

фотоприемнику

оказывается закрытым. Когда

же на

объект попадает измеряющий свет, путь

фотоприемнику открывается. Модулятор фосфороскопического устройства

приводится

движение мотором. Модулированный измеряющий свет,

про-

шедший через образец, попадает

на

фотоумножитель

вызывает переменный

электрический сигнал, который интегрируется

на

большом сопротивлении

на-

грузки

преобразуется

сравнительно медленно изменяющееся напряжение.

Этот сигнал поступает

на

усилитель постоянного тока

затем

на

самопишу-

щий

потенциометр.

Для уменьшения потерь света вследствие значительного светорассеяния

обычно стараются сократить расстояние

между

образцом

фотокатодом фото-

умножителя.

Это

приводит

увеличению телесного

угла,

пределах которого

измеряющий свет, прошедший через кювету

образцом, попадает

на

фотопри-

емник.

После установления образца

кюветное отделение, включения изме-

ряющего света определенной длины волны

компенсации фототока включают

действующий свет

регистрируют кинетику изменения поглощения

Д«/

(( —

|'к)'«к

(')•

При

небольших значениях оптической плотности

образца

|о

пределах

(0,2—0,7)

регистрируемое прибором изменение фото-

тока

будет

пропорционально изменению

его

поглощения,

т. е. А»//

« ЛО.