Рубин А.Б. Современные методы биофизических исследований (Практикум по биофизике)

Подождите немного. Документ загружается.

Затухание флуоресценции после прекращения возбуждения под-

чиняется экспоненциальному закону

/ =

е"'

/т

или In/

-=ln/

—(t/T

Естественное время жизни возбужденного состояния т^ можно

оценить с помощью молярного коэффициента поглощения е. С не-

которым приближением можно считать, что чем больше константа

скорости поглощения, тем быстрее происходит излучение, т. е. тем

больше константа скорости флуоресценции (k

•-•

1/тд).

В соот-

ветствии с формулой Боуэна и Уокса

=-•

2900л*

vl Г edv,

где v

— волновое число в максимуме полосы поглощения,

Jedv

—

площадь под контуром спектральной кривой поглощения, п —

показатель преломления среды.

Поскольку это уравнение

соответствует

случаю

(ц>

•- 1), а силу

диполя и

частоту

легко найти из спектров поглощения, k

можно

определить не измеряя флуоресценцию. В действительности кван-

товый

выход

флуоресценции меньше единицы вследствие существо-

вания

в молекуле безызлучательных процессов; следовательно,

реальное (или измеряемое) время жизни x

окажется меньше:

где k

— константа внутренней конверсии, k

— константа интер-

комбинационной

конверсии в триплетное состояние, k

IQI — про-

изведение бимолекулярной константы на концентрацию тушащих

молекул.

Квантовый

выход

флуоресценции в этом

случае

выражается соот-

ношением

-\-k

\Q\

Отсюда

следует,

что Ту т

;

; kf-- ^

-x

. Поскольку радиационное,

или

естественное, время жизни возбужденного состояния т

можно

рассчитать из спектров поглощения, измерение времени затухания

флуоресценции x

эквивалентно измерению квантового

выхода

;

отсутствие

тушителя k

\Q] квантовый

выход

флуоресценции, обо-

значенный

в этих условиях как cpf, очевидно, зависит лишь от

трех

вышеперечисленных констант:

Так

как ср'/ф, - 1 + k

\Q]/(k

+ k

), то, обозначив

через xf время жизни в

отсутствие

тушителя, получим, что 1/т? =

к,

+ k

(

Ф/

)

- 1

=•

т," *, [Q] - К [Q1.

Последнее уравнение называется

соотношением

Штерна

Фоль-

мера,

а К —

константой

тушения.

Последняя легко опреде-

ляется экспериментально при измерении интенсивностей флуорес-

ценции

различных образцов, отличающихся концентрацией туши-

теля. Для этого достаточно оценить угловой коэффициент прямой

координатах

[/?///

— 1] и [Q].

Так

как для многих полос поглощения полуширина Av

1/2

состав-

ляет около

2000—5000

см-

, а их площадь можно

грубо

аппрокси-

мировать площадью треугольника с вершиной в точке е

тах

, где

тах

— максимальный коэффициент поглощения полосы, то

j edv да 0,3 е

гаах

. Отсюда

следует,

что для приближенных оценок

естественного времени жизни возбужденного состояния \/т

—

--•=

тах

(см. с. 41); п

= 2. Для молекул многих красителей, у ко-

торых е

тах

=• 10

, t

составит около 10~

с.

Так

как т

связано с силой осциллятора (/) выражением т

1,5-lO~

/(/vo)

и в то же время т

—

1/(2900

vjjedv),

то при

•--•=

1 получается, что / -•••

4,3-10~

jedv.

При е

тах

да 10* сила /

близка к единице.

Исходя из определения квантового выхода флуоресценции, с ис-

пользованием закона Ламберта — Бэра можно установить связь

между

интенсивностью флуоресценции / и молярным коэффициен-

том поглощения, а также концентрацией с:

где /

— интенсивность возбуждающего света, (1 — Т) — величина

поглощения, Т — величина пропускания, К — коэффициент про-

порциональности, зависящий от способа измерения.

Так

как D -- — lg Т гс1, где D — оптическая плотность,

с — концентрация, / — толщина слоя вещества, то / = К1

0 —

— 10~°)ф. Выражение в скобках можно разложить в ряд при не-

больших значениях D и ограничиться линейным членом:

Это означает, что при малых оптических плотностях (D <

0,1-f-

4-0,2)

/ пропорциональна концентрации флуоресцирующего веще-

ства и интенсивности возбуждающего света. По этой причине флуо-

ресцентная спектрофотометрия гораздо более чувствительный метод

определения концентраций, чем абсорбционная спектрофотометрия,

поскольку чувствительность флуориметра практически органичи-

вается только максимальной интенсивностью возбуждающего све-

та, а не точностью измерения интенсивности, что необходимо для

определения разности (/„ — /

) при абсорбционном методе. Напри-

мер, если точность измерения lg (IJI) на абсорбционном спектро-

фотометре составляет около 10-

, a e

max

обычно не превышает 10

(для большинства красителей), то минимальная концентрация, ко-

торую

можно определить,

будет

не менее

10~

/10*

= Ю~

М,

тогда

Рис.

15.

Кривые потенци-

альной энергии

для: SJ и So,

пересекающиеся

точке

А:

Д£

— энергетический барьер

как

флуоресцентным методом можно

обнаружить концентрации порядка

ю-

—

ю-

м.

Точное измерение интенсивности

флуоресценции осложняется целым

ря-

дом факторов:реабсорбцией флуоресцен-

ции,

экранированием возбуждающего

света другими молекулами, светорассея-

нием,

гетерогенностью объекта, мигра-

цией

энергии, тушением флуоресценции.

Существует

целый

ряд

специальных

приемов, позволяющих значительно

уменьшить неблагоприятное влияние

указанных выше факторов, которые

бу-

дут рассмотрены позднее.

Как

влияет температура

на

квантовый

выход

флуоресценции

;

наиболее простом варианте

для

разбавленных растворов

с по-

вышением температуры интенсивность флуоресценции уменьшается

за

счет

внутримолекулярной деградации энергии возбуждения (если

исключить межмолекулярные столкновения

за

время жизни

воз-

бужденного состояния). Если рассмотреть пересекающиеся кривые

потенциальной энергии возбужденного

SJ и

основного

состояний,

то

увеличением температуры

на

верхние колебательные уровни

S\ попадает

все

большая часть молекул

возрастает вероятность

перехода через область пересечения потенциальных кривых.

Это

означает,

что

термическая энергия используется

на

преодоление

энергетического барьера потенциальной энергии высотой

А£,

кото-

рый отделяет устойчивое состояние

S\ от

перехода

на S

(рис. 15).

Обозначив суммарную константу безызлучательных процессов

+ k

)

через

отсутствие

тушения, получим,

что ср* = k

/(k

+ k

). С

увеличением температуры

будет

возрастать

за

счет

возрастания констант скоростей внутренней конверсии

и ин-

теркомбинационной

конверсии

триплетное состояние, поскольку

преодолевается энергетический барьер

Д Е (рис. 15) в

области

пе-

ресечения потенциальных кривых.

При

уменьшении температуры

будут

приближаться

к тем

предельным значениям, которые

соответствуют

внутренней

или

интеркомбинационной конверсии

с самого нижнего колебательного уровня первого синглетного

со-

стояния.

Это

означает,

что

если

при

комнатной температуре кван-

товый

выход

близок

единице,

то

величина

ср"

мало изменится

с по-

нижением температуры, однако может значительно уменьшиться

при

повышении температуры. Если квантовый

выход

флуоресцен-

ции

вещества

при

комнатной температуре незначителен,

то с по-

нижением температуры

он

может существенно возрасти.

Так как

можно ожидать,

что kf не

зависит

от

температуры,

то

изменения

ф°

отражают температурную зависимость

. Эта

зависимость

будет

определяться наинизшим активационным барьером

энергией

на

пути плавного перехода с уровня S] на 5

и Т и описываться

уравнением Больцмана

А;„ = «е

Отсюда

где x

— естественное время жизни возбужденного состояния

(т

= l/kf). Величина т

-- К постоянна, и поэтому 1/ср" =

1 + Яе-

> или —In ф? = In K — Ei{kT). Зависимость In <p? от

\1Т

позволяет определить величину энергии активации температур-

ного тушения флуоресценции Е. Так как 1/сру — 1 +

Ке~

Е(кТ)

то с уменьшением температуры квантовый

выход

должен возрастать

по

S-образной кривой, что экспериментально наблюдается для раз-

бавленных растворов флуоресцирующих веществ.

Экспериментально определяемая величина энергии активации для

ряда веществ (анилин, антрацен, диацетил) имеет значения в преде-

лах

17—42

кДж/моль, а коэффициент К при этом подчиняется эмпи-

рическому уравнению К = const

(Т/ц)

/*,

где ц — вязкость раство-

рителя. Таким образом, для термической деградации электронной

энергии

возбуждения необходимо не только преодолеть энергети-

ческий барьер, но и иметь некоторую

свободу

во взаимном переме-

щении

частей молекулы, что зависит от вязкости среды. Очевидно

также, что в присутствии тушителя при возрастании Т интенсив-

ность флуоресценции уменьшится вследствие увеличения вероятно-

сти столкновений молекул тушителя и флуоресцирующего вещества.

Методы

измерения

спектров

флуоресценции

возбуждения

Исследование

спектров

флуоресценции

— зависимости интенсив-

ности излучения от длины волны [/

фл

= /

(А,

фл

)]

— позволяет про-

водить качественный и количественный анализ различных компонен-

тов в биологических и модельных системах, изучать их состояние

(агрегацию, комплексообразование и т. п.) и взаимодействие с дру-

гими компонентами.

По

положению максимума в спектре флуоресценции можно су-

дить о величине кванта энергии, запасаемой в молекуле данного

компонента; сравнение спектров флуоресценции и поглощения

дает

информацию

о миграции энергии в системе. Скорость затухания

флуоресценции позволяет

судить

о времени сохранения энергии

возбуждения в молекуле, что в сочетании со значениями кванто-

вых выходов и скоростями тушения флуоресценции

дает

возмож-

ность проанализировать процессы растраты и миграции энергии.

Для измерения спектров флуоресценции и ее возбуждения обыч-

но

используют установку с

двумя

монохроматорами (на

возбужде-

нии

и регистрации), где источником

служит

ксеноновая лампа или

лампа накаливания, а приемником излучения — фотоумножитель.

Принципиальная

схема

такой установки показана на рис. 16.

Рис.

16. Схема установки для измерения спектров флуоресценции и возбуж-

дения

флуоресценции:

— источник

возбуждающего

света. 2, 4, 6 — фокусирующие линзы, 3 — первый (возбуж

дающий) монохроматор, 5 — кювета с образцом, 7 — второй (регистрирующий) моно-

хроматор, 8 — фотоумножитель, 9 — источник питания фотоумножителя, 10—усилитель.

// — потенциометр; Si—S, — щели монохроматоров

При

измерении спектров флуоресценции и возбуждения по одно-

лучевой

схеме

на установках указанного выше типа возможны ис-

кажения

спектральных кривых за

счет

неодинаковой интенсивно-

сти излучения источника

возбуждающего

света при разных длинах

волн и зависимости чувствительности фотокатода фотоумножителя

от длины волны падающего на него излучения. Пропускание света

всей спектральной установкой также селективно. По этим причи-

нам

записанные спектры необходимо корректировать в соответст-

вии

со спектральной чувствительностью установки, поскольку из-

меряемый фототок не пропорционален интенсивности излучения

Суммарная мощность излучения W (К), равная общей площади

под кривой профиля полосы J / (Я,) d А, обратно пропорциональна

произведению функции спектральной чувствительности фотоумно-

жителя G (А) на пропускание прибора Т (А) и прямо пропорцио-

нальна величине измеренного фототока J (А\):

WCk) =

Это означает, что для измерения мощности и определения значений

спектральной интенсивности излучения [/ (X) =

W(X)/AX]

необ-

ходимо получить систему коэффициентов Къ — 1/IG (к) Т (А,)],

на

которые

следует

умножить регистрируемую спектральную кри-

вую для построения истинного спектра флуоресценции. Такие

коэф-

фициенты

можно получить при измерении на установке спектров

эталонных источников с известным спектральным распределением

мощности.

Точное измерение интенсивности флуоресценции / (К), как уже

отмечалось выше, существенно осложняется вследствие эффектов

светорассеяния, экранирования возбуждающего света другими мо-

лекулами, реабсорбции флуоресценции, миграции энергии и туше-

ния

флуоресценции. Как правило, интенсивность флуоресценции би-

ологических объектов незначительна из-за малой величины кванто-

вых выходов и низкой концентрации флуоресцирующих компонен-

тов. Все это

требует

увеличения чувствительности измеряющей ап-

паратуры, тщательной фокусировки света и специального выбора

оптимальных условий регистрации флуоресценции, позволяющих

исключить влияние «паразитного» свечения кювет, оптики и воз-

можных примесей.

При

измерении спектров флуоресценции биологических объектов

необходимо также учитывать влияние интенсивного возбуждающе-

го света на индуцируемые изменения фотохимически активных ком-

понентов.

Чтобы ослабить влияние возбуждающего света нафото-

индуцируемые процессы,

следует

по возможности уменьшать яр-

кость возбуждающего света на объекте за счет тщательной фокуси-

ровки,

увеличивать скорость измерений и, если позволяют условия

эксперимента, использовать низкотемпературную технику. Для

успешного решения этих задач применяют светосильные монохро-

маторы, чувствительные приемники света и охлаждение образцов

вплоть до температуры жидкого азота (77 К).

Биологические объекты обычно сильно рассеивают свет, что при-

водит к увеличению экранирующего эффекта и реабсорбции (погло-

щение света флуоресценции как исследуемым компонентом, так и

другими компонентами) вследствие увеличения оптического пути.

В наиболее простых ситуациях эффект экранирования можно

учесть,

если известны значения оптической плотности исследуемого веще-

ства D и общая оптическая плотность образца D

при определенной

длине волны возбуждения. В этом

случае

измеряемая интенсивность

флуоресценции может быть исправлена с

учетом

эффекта экраниро-

вания

в соответствии с уравнением, предложенным Ю. А. Владими-

ровым и Ф. Ф. Литвиным:

//=/C/

(l-10-a)cp(D/D

где /J — интенсивность флуоресценции при наличии экранирова-

ния.

Поправочный коэффициент т, на который необходимо умно-

жить регистрируемую интенсивность вещества в смеси, можно най-

ти из соотношения

В сильно разбавленных образцах, где D

<^ 1. коэффициент т ж 1

и,

следовательно, нет необходимости вводить поправки на экрани-

рование

возбуждающего

света.

Можно

учесть

также и эффект реабсорбции, приводящий к

уменьшению коротковолновой части регистрируемой флуорес-

ценции

сдвигу

максимума в длинноволновую область по сравне-

нию

с истинным спектром излучения. Поправочный коэффициент

на

реабсорбцию т аналогичен коэффициенту при экранировании

возбуждающего

света:

(l_lO

т =

где D

— оптическая плотность

всех

реабсорбирующих ве-

ществ при длине волны регистрации флуоресценции. Видно, что

при

достаточно малых ОиО^т'«1. Таким образом, эффект реаб-

сорбции снижается при уменьшении оптической плотности образца.

Это достигается за

счет

уменьшения концентрации вещества и тол-

щины

исследуемого образца, возбуждением и регистрацией флуо-

ресценции

с передней стенки кюветы, возбуждением флуоресцен-

ции

в максимуме поглощения вещества.

Для уменьшения светорассеяния в образце обычно используют

специальные приемы, например инфильтрацию листьев растений

водой, добавление глицерина к суспензии хлоропластов или хрома-

тофоров и т. п. Для уменьшения интенсивности рассеянного света в

монохроматоре перед входной щелью помещают светофильтры, кото-

рые пропускают свет только в исследуемом спектральном диапазоне

(поэтому необходимо знать спектральный состав рассеянного света,

зависящий

от распределения энергии в спектре излучения источ-

ника

и от монохроматора). Определенные преимущества имеют

спектрофотометры с двойным монохроматором, позволяющим в зна-

чительной мере избавиться от «паразитного» рассеянного света.

Ранее уже отмечалось, что при малых концентрациях вещества

растворе поглощение пропорционально оптической плотности и

концентрации

люминесцирующего вещества: (1 — Т) ~ D ~ с.

Таким

образом, для определения концентрации вещества достаточно

сравнить интенсивности флуоресценции исследуемого раствора и

контрольного раствора известной концентрации. Тогда с

----- cl

где с

— определяемая концентрация вещества, флуоресцирующе-

го с интенсивностью /

, с — концентрация вещества, флуоресци-

рующего

с интенсивностью / в контрольном растворе. Поскольку

с повышением концентрации величина (1 — Т) уже не пропорцио-

нальна с, интенсивность люминесценции начиная с определенного

предела не

будет

зависеть от концентрации вещества. Поэтому в кон-

центрированных растворах количественные определения концент-

рации

по интенсивности флуоресценции практически невозможны.

Метод регистрации спектров собственной флуоресценции раз-

личных биомолекул или специальных

флуоресцентных

зондов

(меток), вводимых

изучаемую

макромолекулу

(или

биострукту-

ру),— удобный инструмент

для

конформационного анализа. Разли-

чают

флуоресцентные зонды-красители, которые связываются

с био-

логическими мембранами нековалентно,

флуоресцентные метки,

связанные химической связью. При включении метки (зонда)

мак-

ромолекулу

или

биомембрану флуоресцентные свойства таких

кра-

сителей изменяются

дают

информацию

структурных

особенно-

стях изучаемой системы. Флуоресцентные зонды, слабо флуоресци-

рующие

воде

(например, анилинонафталинсульфонат), значи-

тельно увеличивают свой квантовый

выход

при

связывании

с бел-

ками

нуклеиновыми кислотами.

При

изменении свойств микро-

окружения

месте связывания зонда (заряда, микровязкости

т.

п.)

меняются интенсивность

спектр флуоресценции, отражаю-

щие конформационные перестройки изучаемой биоструктуры

или

макромолекулы.

Измерение

спектров флуоресценции таких присоединенных

ме-

ток

зондов особенно важно при изучении свойств нуклеиновых кис-

лот вследствие малой интенсивности собственной флуоресценции

их

оснований.

Относительная чувствительность метода

использова-

нием

флуоресцентных зондов существенно превышает соответст-

вующее

значение

и для

большинства собственных хромофоров

бел-

ков.

Флуоресценция обычно гораздо более чувствительна

окру-

жению хромофора,

чем

поглощение. Кроме того, поскольку погло-

щение происходит

за

время порядка

10~

с,

свойства молекулы

и ее

окружения практически

не

успевают

измениться. Однако

в воз-

бужденном состоянии молекула пребывает более длительное время

(К)-

—

10~

с), поэтому

течение этого периода

могут

произойти

различные процессы (например, локальные конформационные

из-

менения,

протонирование

депротонирование, релаксация моле-

кул растворителя

и т. п.),

которые отразятся

на

флуоресцентных

свойствах самой молекулы

или

соответствующего зонда.

Действительно, хорошо известно,

что

положение полосы

спект-

ре флуоресценции гораздо сильнее изменяется

зависимости

от

природы растворителя,

чем в

соответствующем спектре поглощения.

Это явление отражает влияние переориентации диполей молекул

растворителя

на

положение возбужденного синглетного уровня

растворенной молекулы

который

за

счет

увеличения энергии соль-

ватации понижается. Таким образом, метод флуоресцентной спектро-

скопии

по

целой совокупности свойств оказывается более чувстви-

тельным,

чем

абсорбционный метод.

При

освещении флуоресцирующего объекта монохроматическим

светом интенсивность флуоресценции

;

будет

различаться

при

разных длинах волн

возбуждающего

света

поскольку

If за-

висит

от

интенсивности падающего (возбуждающего) света

при

каждой длине волны

и от

величины поглощения

(1 — Т):

K(l-T)<p,

где К — коэффициент, характеризующий чувствительность регист-

рирующего прибора, ф — квантовый выход.

Спектром

возбуждения

флуоресценции называется зависимость

интенсивности

флуоресценции от длины волны возбуждающего

света:

Если

квантовый

выход

постоянен, то спектр возбуждения флуо-

ресценции

будет

совпадать по форме с кривой поглощения (1 —Т) =

f (X). При небольшом поглощении величина (1 — Т) пропорцио-

нальна

оптической плотности D и />//„ « 2,3

K<pD,

т. е. при малых

D (например, в разбавленных растворах индивидуальных веществ)

спектр возбуждения флуоресценции вещества по формуле совпадает

его спектром поглощения.

Если

(1 — Т) = 1 (полное поглощение возбуждающего света),

спектр возбуждения отражает зависимость квантового выхода

от длины волны возбуждающего света: I

= Кц>- Таким об-

разом,

для концентрированных растворов вещества спектр возбуж-

дения

постоянен и не зависит от длины волны возбуждающего све-

та, что соответствует закону Вавилова о независимости <р от Х

Схема для измерения спектров возбуждения флуоресценции

приведена на рис. 16. В отличие от регистрации спектров флуорес-

ценции

при измерении спектров возбуждения непрерывная разверт-

ка

по длинам волн осуществляется на первом (возбуждающем)

монохроматоре, в то время как второй (регистрирующий) монохро-

матор настроен на определенную длину волны флуоресценции. Для

получения истинного спектра возбуждения необходимо определить

интенсивность

возбуждающего света при различных длинах волн

= / (X). Для этого обычно измеряют относительную энергию на

выходе

монохроматора с помощью неселективного приемника света

(болометра или термопары), а затем пересчитывают ее на количество

квантов.

При отсутствии неселективных приемников (например, в

ультрафиолетовой области) применяют стандартные флуоресци-

рующие образцы с постоянным «р, которые полностью поглощают

падающий свет, трансформируя его затем во флуоресценцию, изме-

ряемую фотоумножителем (флуоресцин, триптофан и ряд

других

веществ соответствующей концентрации; флуоресцирующий свето-

фильтр ЖС-9). Затем, разделив I

= f (X) на /

= / (X), при каж-

дом значении X (например, через 1,5—2 им) получают спектр воз-

буждения исследуемого компонента.

Измерение

спектров возбуждения флуоресценции имеет важное

значение

для решения целого ряда задач. Так, спектр возбуждения

дает

возможность установить спектр поглощения компонента, ко-

торый флуоресцирует в исследуемой спектральной области, что поз-

воляет идентифицировать этот компонент. Было установлено, на-

пример,

что спектр возбуждения растворов белков, флуоресцирую-

щих в диапазоне

300—370

нм, совпадает со спектром поглощения

триптофана.

Это означает, что за флуоресценцию белковых молекул

указанной области ответствен исключительно триптофан.

Важно подчеркнуть, что метод измерения спектров возбуждения

особенно

удобен для тех образцов, на которых прямые абсорбцион-

ные

измерения затруднены. Сравнительное изучение спектров воз-

буждения и флуоресценции позволяет обнаружить миграцию энер-

гии

возбуждения

между

различными компонентами в сложных сис-

темах. Так, если в двухкомпонентных системах флуоресцирует толь-

ко

один компонент, а в спектре возбуждения этой флуоресценции

зарегистрированы полосы, соответствующие поглощению обоих

компонентов,

это означает, что в данной системе происходит мигра-

ция

энергии с одного компонента на другой. Именно таким образом

была обнаружена миграция энергии с каротиноидов и хлорофилла Ь

на

хлорофилл а в высших растениях и зеленых водорослях, которая

осуществляется практически со 100%-ной эффективностью. Можно

было бы привести и целый ряд

других

примеров. Необходимо обра-

тить внимание еще раз на то, что измерения спектров возбуждения

следует

проводить при малых значениях оптических плотностей

(D в максимуме поглощения должна составлять не более 0,1 —0,2

единиц).

Количественная оценка миграции энергии для простой

двух

компонентной

системы (смесь веществ А к В) может произво-

диться с использованием соотношения

q = (n

)(l/D

) [D

/(n

)) = п

/(D

где D

, D

, n

— компоненты разложения суммарного

спектра поглощения и возбуждения, соответствующие поглощаю-

щим

веществам А к В. Если, например, в такой двухкомпонент-

ной

системе

отсутствует

миграция энергии с Л на В, то в спектрах

возбуждения при регистрации в полосе флуоресценции вещества В

будет

наблюдаться лишь максимум, соответствующий поглощению

В (q = 0),

тогда

как при полной миграции с Л на В в таком спект-

ре появится второй максимум, совпадающий по всем параметрам

максимумом поглощения вещества A (q — 1; 100%-ная эффектив-

ность).

Во всех промежуточных ситуациях (различная эффектив-

ность

миграции с А на В) в спектрах возбуждения флуоресценции В

интенсивность

полосы, соответствующей поглощению А,

будет

варь-

ировать (0 <. q <С 1).

Аналогом спектра возбуждения флуоресценции можно считать

спектр

действия,

т. е. зависимость какого-либо эффекта Р (биоло-

гического, фотохимического и т.п.), отнесенного к числу падаю-

щих квантов п

, от длины волны возбуждающего света: Р/п

=f (k).

Измерение

спектра действия — очень важный метод для идентифи-

кации

компонентов, ответственных за тот или иной процесс, для

выяснения

механизма его отдельных стадий. При этом спектры дей-

ствия

обычно сопоставляют со спектрами поглощения целой систе-

мы

и ее отдельных компонентов. Регистрация спектров действия —

необходимый этап исследования фотобиологических процессов. Так