Волова Т.Г. Введение в биотехнологию. Методические указания по лабораторным работам

Подождите немного. Документ загружается.

МОДУЛЬ 2. ПРОМЫШЛЕННАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Работа 2.2. Периодическое культивирование микроорганизмов и культивирование с подпиткой субстратом



Введение в биотехнологию. Метод. указания по лабораторным работам

-21-

мов. При этом наблюдаемая скорость роста будет определяться разностью

между действительной скоростью роста и скоростью отмирания клеток.

Простейшее лабораторное оборудование для выращивания микро-

организмов в периодическом режиме включает термостатируемую качал-

ку или магнитные мешалки, на которые устанавливаются колбы (рис.

2.2).

1 0

1 1

1 2

1 3

Рис. 2.2. Аппаратурная схема культивирования микроорганизмов

в периодическом режиме: 1 – бытовой холодильник; 2 – коллекция штаммов;

3 – бокс-ламинар; 4 – УФ-облучатели; 5 – колба; 6 – фильтр НЕРА; 7 – качалка; 8 – колбы;

9 – платформа для колб; 10 – электродвигатель; 11 – блок термостабилизации;

12 – колбы на магнитных мешалках; 13 – регулятор тока

1. Музейная культура штамма R. eutrophus B-5786;

2. Стерильный раствор базового фосфатного буфера для среды;

3. Маточные стерильные растворы микроэлементов, железа лимонно-

кислого, сульфата магния и хлористого аммония;

4. Шпатели, спиртовка, мерная посуда, пипетки, колбы для выращива-

ния бактерий, резиновые пробки с микробиологическими фильтрами;

5. Термостатируемая качалка, газгольдер, вакуумный насос, газовые

субстраты (водород, кислород, углекислота).

1. Приготовить питательную среду для выращивания бактерий: в мик-

робиологическом боксе к 0,5 л основной среды (фосфатный буфер) в сте-

рильных условиях над спиртовкой добавить 2,5 мл стандартного раствора

железа, 1,5 мл раствора микроэлементов, 2 мл раствора сульфата магния и

требуемый объем раствора хлорида аммония (в 1 мл которого содержится

100 мг соли); углеродный субстрат (из расчета 10 г/л фруктозы).

2. Инокулят разлить в три ферментационные колбы по 100 мл (пять

биологических повторностей для периодической культуры и 5 – для культу-

ры с подпиткой субстратом), используя стерильную мерную посуду.

3. Колбы плотно закрыть резиновыми пробками;

4. Колбы подписать (например, 1а, 1б, 1в и т.д.);

МОДУЛЬ 2. ПРОМЫШЛЕННАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Работа 2.2. Периодическое культивирование микроорганизмов и культивирование с подпиткой субстратом



Введение в биотехнологию. Метод. указания по лабораторным работам

-22-

5. Измерить исходную оптическую плотность культуры;

6. Колбы установить на качалку;

7. В 5 колб для культивирования с подпиткой субстратом через 12, 24 и

36 ч после начала роста культуры внести добавку углеродного субстрата ( из

расчета 1-2 г/л л);

8. Периодически производить отбор проб для измерения оптической

плотности культуры на ФЭК и микроскопирования клеток.

9. Данные занести в табл. 2.1

Таблица 2.1

Показатели роста культуры R. eutropha

в ходе развития периодической культуры

Группа

Исходные

показатели ино-

кулята

Текущие

показатели

культуры

ОП

Х, г/л

ОП

Х, г/л

№ 1

Время от на-

чала опыта, ч

№ 2 ( с под-

питкой субстратом)

Время от на-

чала опыта, ч

10. По результатам эксперимента построить кривую накопления

биомассы культур.

1. Каковы основные требования к организации периодического культи-

вирования микроорганизмов?

2. Какие основные характеристики микробного роста в периодической

культуре?

3. Каковы отличия и преимущества периодического режима культи-

вирования микроорганизмов с подпиткой субстратом?

ь: дать представление о методах, инструментальном оформлении и

возможностях метода проточных культур.

Метод проточного культивирования вошел в микробиологию и базиру-

ется на процессах химической технологии. Принцип проточного культивиро-

МОДУЛЬ 2. ПРОМЫШЛЕННАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Работа 2.3. Проточные культуры: хемостат, турбидостат



Введение в биотехнологию. Метод. указания по лабораторным работам

-23-

вания состоит в том, что в сосуд, где размножаются микроорганизмы, не-

прерывно подается свежая питательная среда и одновременно вытекает та-

кой же объем культуры. По такому принципу организуются два различных

процесса культивирования: процесс полного вытеснения и процесс полного

смешения. В первом случае сосуд для выращивания представляет собой

трубку, тубулярный ферментер, в которой втекают среда и посевной мате-

риал и вытекает культура. Перемешивание не производится (рис. 2.3).

ХS

+ +

Рис. 2.3. Схема тубулярного биореактора полного вытеснения: s

– концентрация

субстрата в поступающей среде; i – то же в вытекающей среде;

– то же в ферментере; плотности: х± – подаваемой популяции,

– вытекающей культуры; х – популяции в ферментере

Подобным образом можно культивировать микроорганизмы, не тре-

бующие аэрации. У одного конца ферментера, куда подается среда и культура,

клетки находятся в начале стадии роста; по мере прохождения клетками труб-

ки культура "стареет", исчерпывается субстрат, накапливаются продукты ме-

таболизма и перед вытеканием культура находится в состоянии, аналогичном

стационарной фазе роста периодической культуры. Таким образом, в трубке

воспроизводится полная кривая роста, но не во времени, а в пространстве.

Непрерывные процессы. В непрерывных процессах биообъект постоянно

поддерживается в экспоненциальной фазе роста. Обеспечивается непрерыв-

ный приток свежей питательной среды в биореактор и отток из него куль-

туральной жидкости, содержащей клетки и продукты их жизнедеятельности.

Фундаментальным принципом непрерывных процессов служит равновесие

между приростом биомассы за счет деления клеток и их убылью в результате

разбавления свежей средой:

μ=D ,

где μ — удельная скорость роста клеток, D — коэффициент разбавления

(скорость убыли концентрации клеток). Различают хемостатный и турбидо-

статный режимы непрерывного культивирования.

В процессе полного смешения рост происходит в емкости – фер-

ментере при интенсивном перемешивании (рис. 2.4).

МОДУЛЬ 2. ПРОМЫШЛЕННАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Работа 2.3. Проточные культуры: хемостат, турбидостат



Введение в биотехнологию. Метод. указания по лабораторным работам

-24-

1 12 2

5 6

A Б

Рис. 2.4. Схемы биореакторов для проточного культивирования микроорганизмов:

А – хемостат; Б – турбидостат с автоматической регуляцией оптической плотности;

1 – поступление среды, 2 – мешалка, 3 – сток культуры, 4 – насос, 5 – фотоэлемент,

6 – источник света

Перемешивание достигается продуванием воздуха или работой

мешалки либо тем и другим способом одновременно. Во всей массе

культуры условия должны быть совершенно одинаковыми. Этот метод

культивирования называется гомогенно-непрерывным или гомогенно-

проточным. В ферментере создаются условия, соответствующие одной

точке кривой роста. При быстром протоке среды эти условия близки к

быстрому экспоненциальному росту, при медленном – приближаются к

условиям стационарной фазы. При таком методе культивирования может

быть воспроизведена любая периодическая культура от начала замед-

ления роста после экспоненциальной фазы и до конца стадии замедле-

ния роста. В установившемся режиме скорость протока среды равняет-

ся удельной скорости роста культуры. При этом культура находится в

устойчивом состоянии динамического равновесия и обладает способно-

стью подстраиваться к изменениям условий.

При хемостатном режиме культивирования в биореактор с постоянной

контролируемой скоростью вливают питательную среду, один из компонен-

тов которой, часто Ог, поступает в количестве, не достаточном для обеспе-

чения максимальной скорости роста культуры. В этом случае реактор с био-

объектом приобретает свойства саморегулирующейся системы, автоматиче-

ски удовлетворяющей равенству μ=D . Если первоначально скорость раз-

бавления и вымывания биомассы превышает скорость роста клеток, то на-

ступает разбавление культуры свежей средой. Это ведет к повышению концен-

трации компонента, ограничивающего рост, вследствие чего скорость роста

культуры увеличивается. Как только μ превысит D, в реакторе начинает

концентрироваться биомасса. Увеличивающаяся популяция клеток все

активнее «выедает» субстрат, его концентрация падает, что, в свою оче-

редь, ведет к торможению роста культуры. Таким образом, после серии

затухающих колебаний скорость роста культуры становится равной ско-

рости ее разбавления.

МОДУЛЬ 2. ПРОМЫШЛЕННАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Работа 2.3. Проточные культуры: хемостат, турбидостат



Введение в биотехнологию. Метод. указания по лабораторным работам

-25-

Биореактор, работающий в хемостатном режиме культивирования, на-

зывают хемостатом. Он включает: 1) устройство для вливания питательной

среды; 2) выпускное приспособление для оттока культуральной жидкости с

клетками; 3) систему контроля скорости протока (рис. 2.4, А).

Один из простейших вариантов хемостата содержит насос, постоянно

нагнетающий питательную среду в биореактор, и выпускную трубу, по кото-

рой жидкость из биореактора вытекает, как только ее уровень поднимается

выше горловины этой трубы. Альтернативный вариант — выпускная труба

входит в полость биореактора сверху и нижний обрез ее горловины соот-

ветствует уровню, выше которого жидкость не должна подниматься. Если

этот уровень превышен, избыток культуральной среды с клетками отсасыва-

ется насосом, подсоединенным к выпускной трубе.

Турбидостатный режим культивирования основан на прямом контроле

концентрации биомассы. Наиболее распространено измерение светорассея-

ния содержимого биореактора с помощью фотоэлемента. Сигнал от фото-

элемента управляет скоростью протока жидкости, в свою очередь опреде-

ляющего скорость роста культуры (рис. 2.4, Б). Повышение концентрации

клеток и соответственно светорассеяния автоматически приводят к ускоре-

нию протока жидкости, разбавляющей культуру, и, наоборот, убыль биомас-

сы компенсируется замедлением протока.

Концентрация клеток может оцениваться также по косвенным кри-

териям (по измерению рН, убыли субстрата или накоплению продуктов

жизнедеятельности). Непрерывное культивирование, осуществляемое в од-

ном биореакторе, обозначается как одностадийное. Многостадийное культи-

вирование с последовательным или каскадным расположением реакторов

позволяет внедрить принцип дифференцированных режимов в непрерывные

биотехнологические процессы. Эти дифференцированные режимы не сме-

няют друг друга во времени, а одновременно осуществляются в последова-

тельно расположенных аппаратах. Например, в первом из биореакторов соз-

дают оптимальные условия для роста культуры, а во втором — для био-

синтеза целевого продукта.

Принципиальная схема лабораторного биореактора (ферментера)

представлена на рис. 2.5.

МОДУЛЬ 2. ПРОМЫШЛЕННАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Работа 2.3. Проточные культуры: хемостат, турбидостат



Введение в биотехнологию. Метод. указания по лабораторным работам

-26-

1 4

1 5

1 6

1 0

1 1

1 2

1 7

1 8

1 9

2 0

В Р

2 1

1 3

2 2

2 3

2 4

2 5

2 6

в о д а

п а р

о б о р о т н ы й в о з д у х

в о з д у х

В З

В Р

1 5

В Р

1 8

В Р

2 0

В Р

2 1

В Р

1 0

В Р

2 2

В З

2 7

2 8

2 9

3 0

Рис. 2.5. Аппаратурная схема ферментёра-инокулятора: 1 – биореактор; 2 – барботёр;

3 – теплообменная рубашка; 4 – измерительная ячейка; 5 – турбинная мешалка;

6 – термопара; 7 – регулирующий клапан; 8 – контактный термометр;

9 – дифференциальный манометр; 10 – диафрагма; 11 – конденсатор; 12 – сепаратор;

13 – фильтр стерилизации воздуха; 14 – компрессор; 15 – перистальтический насос;

16 – ёмкости для подпитывающих растворов; 17 – электродвигатель; 18 – шкив;

19 – ремень привода; 20 – электро-контактный манометр; 22 – 24, 26 фильтры;

25 – редуктор; 27 – вход и выход воды; 28 – штуцер; 29 – крепёжные гайки; 30 – манометр

1. Лабораторный ферментационный комплекс «Bio-Flo»;

2. Стерильные растворы для приготовления питательной среды;

3. Инокулят (посевная культура);

4. ФЭК;

5. Стеклянная посуда, колбы, мерные стаканы, пипетки, бюксы.

1. В микробиологическом боксе (или боксе-ламинаре) из маточных

стерильных растворов приготовить 1 л питательной среды;

2. В обработанную УФ-облучателями комнату внести необходимое

оборудование (среда, инокулят);

3. Склянку со средой соединить с насосом-дозатором, подключенным к

ферментеру;

4. В ферментер влить инокулят (1 л);

5. Включить аэропомпу;

6. Включить систему перемешивания и термостабилизации;

7. Замерить исходную оптическую плотность (ОП) инокулята;

8. Фиксировать в рабочем журнале (таблица 2.2) температуру культу-

ры;

МОДУЛЬ 2. ПРОМЫШЛЕННАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Работа 2.3. Проточные культуры: хемостат, турбидостат



Введение в биотехнологию. Метод. указания по лабораторным работам

-27-

9. При достижении температуры культуры 30

С начнется рост культу-

ры;

10. Периодически (через 30 мин) отбирать пробы для определения оп-

тической плотности культуры. При оптической плотности культуры 0,1

(без разведения) включить насос-дозатор на минимальную скорость протока

(0,1 ч-1);

11. Ежечасно определять ОП культуры;

12. При увеличении ОП постепенно увеличивать скорость протока сре-

ды до состояния steady-state ( величина Х, г/л – постоянна);

13. Вычислить значение удельной скорости роста культуры, опреде-

лить время достижения состояния steady-state, получить культуру (хранить в

холодильнике) для последующих занятий.

1. В чем принципиальное отличие проточной культуры от периодической?

2. Каковы основные требования к организации проточной ферментации?

3. Каковы преимущества проточной культуры?

4. Что позволяет техника проточных культур?

: освоение техники ведения процесса выращивания микроорганиз-

мов с лимитированием субстрата для нахождения условий роста, влияющих

на биохимическую программу синтеза макромолекул.

Процессы микробного синтеза делятся на два типа: 1). процессы, свя-

занные с ростом биомассы и происходящие параллельно со скоростью раз-

множения клеток, и 2). процессы, происходящие или ускоряющиеся при за-

медлении скорости роста клеток. Оптимизация обоих типов процессов осу-

ществляется различными путями в зависимости от того, насколько совпада-

ют (или не совпадают) оптимизация скорости роста со скоростью синтеза

макромолекул той или иной природы.

Процесс роста – это процесс синтеза первичных метаболитов (амино-

кислот, органических кислот, витаминов, нуклеотидов, промежуточных про-

дуктов катаболизма) и их сборка в основные клеточные макромолекулы

(белки, нуклеиновые кислоты, полимеры, образующие клеточную стенку).

Рост и синтез этих продуктов максимален, когда клетка максимально обеспе-

чена субстратом. В периодической культуре это имеет место в экспоненци-

альной – начале линейной фазы роста. Таким образом, оптимизация процесса

накопления максимальной биомассы клеток в культуре и синтеза первичных

продуктов обмена сводится к оптимизации условий питания и созданию ус-

ловий сбалансированного роста для культуры. Накопление продуктов обме-

на, происходящих во второй фазе развития культуры (конец линейной – ста-

МОДУЛЬ 2. ПРОМЫШЛЕННАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Работа 2.4. Проведение процесса ферментации с лимитированием субстрата



Введение в биотехнологию. Метод. указания по лабораторным работам

-28-

ционарная фаза), – запасных соединений (полифосфатов, полисахаров, липи-

дов) или вторичных продуктов обмена (антибиотиков, терпенов, стероидов),

имеет для микробной технологии большое значение. Накопление запасных

соединений в клетках имеет место при несбалансированном росте вследствие

исчерпания из среды какого-либо биогена и лимитирования процесса синтеза

основных макромолекул. Синтез вторичных продуктов обмена (идиолитов)

имеет место в случае замедления и остановки роста клеток в конце развития

популяции (конец стационарной фазы – фаза отмирания), когда происходит

дерепрессия ферментов, катализирующих реакции образования данных со-

единений и репрессированных на стадии сбалансированного роста. Оптими-

зация процесса синтеза запасных соединений и вторичных метаболитов бо-

лее сложна, так как требует специальных знаний о закономерностях образо-

вания тех или иных макромолекул и специфических подходов в каждом кон-

кретном случае.

При лимитации роста микроорганизмов отдельными элементами мине-

рального питания происходит замедление скорости роста клеток, сопровож-

дающееся значительными изменениями химического состава, главным обра-

зом, соотношения основных и запасных макромолекул. Выявление принци-

пиальных закономерностей этих изменений открывает широкие возможности

для направленного изменения составом микробной биомассы и целевого по-

лучения конкретных продуктов микробиологического синтеза. Более того,

помимо изменения направленности биохимической программы синтеза ос-

новных и запасных соединений лимитация роста клеток тем или иным мине-

ральным элементом позволяет дополнительно регулировать химическую

структуру отдельных соединений, входящих в состав клеток.

Отправным моментом является изменение соотношения C/N в пита-

тельной среде. Клетки, лимитированные по азоту и не способные синтезиро-

вать основные соединения (белки и нуклеиновые кислоты), потребляя угле-

род, направляют его на образование различных безазотистых соединений уг-

леводной и липидной природы. Качественный состав запасных соединений,

синтезируемых при лимитации роста микроорганизмов по азоту на фоне из-

бытка углерода (увеличение отношения C/N), определяется спецификой фи-

зиолого-биохимических свойств конкретных микробных видов, а также

штаммов.

1. Музейная культура штамма R. eutrophus B–5786;

2. Стерильный раствор базового фосфатного буфера для среды;

3. Маточные стерильные растворы микроэлементов, железа лимонно-

кислого, сульфата магния и хлористого аммония;

4. Шпатели, спиртовка, мерная посуда, пипетки, колбы для выращива-

ния бактерий, резиновые пробки с микробиологическими фильтрами;

5. Термостатируемая качалка (или шейкер-инкубатор).

МОДУЛЬ 2. ПРОМЫШЛЕННАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Работа 2.4. Проведение процесса ферментации с лимитированием субстрата



Введение в биотехнологию. Метод. указания по лабораторным работам

-29-

1. Приготовить 4 варианта среды с различными концентрациями хло-

ристого аммония в среде (0,8; 0,4; 0,2 и 0,1 г/л):

– в микробиологическом боксе к 0,5 л фосфатного буфера над спиртов-

кой (или в боксе-ламинаре) добавить 2,5 мл стандартного раствора железа,

1,5 мл раствора микроэлементов, 2 мл раствора сульфата магния и требуемый

объем раствора хлорида аммония (в 1 мл которого содержится 100 мг соли);

раствор углеродного субстрата (из расчета 5 – 10 г/л фруктозы);

– около 200 мл среды отбросить;

– оставшиеся 300 мл среды засеять инокулятом, смыв культуру с одной

музейной пролбикиго (использовать шпатели);

– инокулят разлить в три ферментационные колбы по 100 мл (три био-

логические повторности), используя стерильную мерную посуду;

– колбы закрыть ватно-марлевыми пробками;

– колбы подписать (например, 1а, 1б, 1в);

– на ФЭК измерить оптическую плотность (без разведения) каждого

инокулята;

– колбы установить на качалку.

2. В течение 3–4 дней проводить измерения оптической плотности

культуры и по калибровочной кривой – определить концентрацию биомассы

в культуре Х, г/л.

3. Данные занести в табл. 2.3

Таблица 2.3

Показатели роста культуры R. eutropha при различной обеспеченности азотом

Группа

Текущие

показатели

культуры

ОП

Х, г/л

№ 1

Время от

начала

опыта, ч

№ 2

Время от

начала

опыта, ч

№ 3

Время от

начала

опыта, ч

№ 4

Время от

начала

опыта, ч

МОДУЛЬ 2. ПРОМЫШЛЕННАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Работа 2.4. Проведение процесса ферментации с лимитированием субстрата



Введение в биотехнологию. Метод. указания по лабораторным работам

-30-

1. В чем специфика метаболизма водородокисляющих хемоавтотроф-

ных микроорганизмов?

2. В чем основные трудности культивирования газоиспользующих

микроорганизмов?

3. Что позволяет фиксировать в ходе культивирования водородных

бактерий метод Шлегеля?

ы: обучение нахождению основных характеристик микроб-

ной культуры на основе экспериментальных результатов.

а является одним из основных показателей, характери-

зующих адекватность условий ферментации для микроорганизмов. Скорость

роста (увеличение биомассы) организмов с бинарным делением в хорошо пе-

ремешиваемой среде в периодической культуре будет пропорциональна кон-

центрации микробной биомассы:

dX/d t= µX, (1)

где dX/dt – скорость роста, Х – биомасса, µ – коэффициент пропорционально-

сти («удельная скорость роста»); параметр аналогичен сложным процентам

(например, если удельная скорость роста равна 0,1 ч

–1

, значит увеличение

биомассы равно 10 % в час). Если величина µ постоянна, как это бывает в ус-

тановившемся режиме культивирования, то интегрирование представленного

уравнения дает

lnX = lnX

(2)

где Х

– биомасса в начальный период времени t.

График зависимости lnX от времени будет иметь вид прямой линии с

наклоном µ.

Валовая (или общая) скорость роста v характеризуется абсолютным

приростом биомассы за единицу времени:

v=dX/dt.

(3)