Волова Т.Г. Введение в биотехнологию. Методические указания по лабораторным работам

Подождите немного. Документ загружается.

МОДУЛЬ 2. ПРОМЫШЛЕННАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Работа 2.5. Определение кинетических параметров культуры по данным эксперимента роста .



Введение в биотехнологию. Метод. указания по лабораторным работам

-31-

Обе величины, удельная и общая скорость роста, характеризуют дан-

ную культуру в данных условиях и не являются количественной характери-

стикой штамма.

Рост культуры µ характеризуется кривой зависимости плотности попу-

ляции (биомассы) Х от концентрации субстрата S, обычно имеющей широкое

плато (зону независимости величины биомассы от концентрации биогена)

(рис. 2.6, а

). Когда скорость роста микробной культуры ограничена не дефи-

цитом субстрата, а воздействием ингибитора, кривая зависимости величины

биомассы от концентрации ингибитора имеет иной вид (рис. 2.6, б

Рис. 2.6. Зависимость скорости роста микробной культуры от концентрации

субстрата: а – зависимость µ от S (концентрации минерального субстрата);

б – зависимость µ от I (концентрации ингибитора)

а микробного роста характеризуется количеством

продукта, получаемого на единицу объема биореактора в единицу времени.

Продуктивность процесса зависит от многих факторов: активности проду-

цента, значений коэффициента выхода продукта из потребленного субстрата,

количества активной биомассы в ферментере:

П = q

p/s

X, г/л ч,

(4)

где q

– скорость потребления субстрата (метаболический коэффициент),

p/s

– выход продукта (экономический коэффициент), X – концентрация био-

массы, P – продукт, S – субстрат.

(

т) определяется как количе-

ство продукта, получаемого из данного количества субстрата:

Y = X/S

– S,

(5)

где S и S

– конечная и исходная концентрации субстрата.

Данный коэффициент выражает эффективность использования суб-

страта для получения целевого продукта и является очень важной характери-

стикой, так как непосредственно связан с продуктивностью и позволяет не-

посредственно влиять на себестоимость конечного продукта. Экономический

МОДУЛЬ 2. ПРОМЫШЛЕННАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Работа 2.5. Определение кинетических параметров культуры по данным эксперимента роста .



Введение в биотехнологию. Метод. указания по лабораторным работам

-32-

коэффициент имеет четкий физический смысл, характеризующий степень

перехода энергии, заключенной в субстрате, в продукт. Данная величина не-

обходима для расчетов и прогнозирования процесса в целом и используется в

качестве параметра для контроля и управления ходом различных процессов и

сопоставления их эффективности.

Основой для изучения кинетики роста микробных культур является ме-

тод острых опытов; этим методом определяют основные показатели роста:

субстратную константу K

, константу ингибирования K

, максимальную ско-

рость роста µ

max

и влияние на них внешних факторов. Для этого клетки из

экспоненциальной фазы роста помещают на короткий промежуток времени в

среды с различной концентрацией исследуемого субстрата и через короткий

промежуток времени t

–

измеряют плотность культуры и вычисляют

удельную скорость роста по уравнению (2

). В контроле скорость роста не

лимитирована субстратом, в экспериментальных пробах – лимитирована за-

данной концентрацией исследуемого субстрата. Полученные результаты об-

рабатываются по методу обратных величин Лайнуевера и Берка, µ

max

и K

строится график зависимости 1/ и 1/S, после этого графически находятся ве-

личины (рис. 2.7

Рис. 2.7. Схема определения µ

max

и K

методом обратных величин (по Лайнуеверу

и Берку): а – зависимость µ от S: б – прямая отсекает 1/µ

max

и 1/K

Аналогичным способом находят константу ингибирования (K

), к про-

бам растущей культуры добавляют различные дозы ингибитора и заменяют

скорость роста при различных концентрациях последнего. Далее строится

график, по которому графически определяют искомые величины: µ

max

и K

(рис. 2.8

МОДУЛЬ 2. ПРОМЫШЛЕННАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Работа 2.5. Определение кинетических параметров культуры по данным эксперимента роста .



Введение в биотехнологию. Метод. указания по лабораторным работам

-33-

Рис. 2.8. Схема определения µ

max

и K

методом обратных величин (по Лайнуеверу

и Берку): а – зависимость µ от I: б – прямая отсекает 1/µ

max

и 1/ K

Персональный компьютер.

1. Используя известные уравнения, определить значения удельной ско-

рости роста при заданных (четырех) концентрациях азота в среде (из резуль-

татов табл.1), а также вычислить продуктивность культуры и экономический

коэффициент по азоту. Значения занести в табл. 2.4

Таблица 2.4

Влияние концентрации NH

Cl в среде на характеристики культуры R. Еutropha

Cl,

г/л

Средняя (ва-

ловая) ско-

рость роста

R.eutropha

Удельная

скорость рос-

та R.eutropha

Продук-

тивность

культуры,

г/л ч

Экономи-

ческий

коэффи-

циент

Y, г/г

2. Построить график зависимости удельной скорости роста бактерий

R.eutropha от концентрации NH

Cl в среде.

μ, 1/ч

Cl, г/л

3. Используя графоаналитический метод Лайнуевера – Берка построить

график зависимости обратных величин удельной скорости роста от обратной

величины концентрации азота в среде.

МОДУЛЬ 2. ПРОМЫШЛЕННАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Работа 2.5. Определение кинетических параметров культуры по данным эксперимента роста .



Введение в биотехнологию. Метод. указания по лабораторным работам

-34-

1/μ, ч

1/S NH

Cl, л/г

4. Вычислить и записать найденные значения K

культуры R. eutropha.

1. Каковы основные продукционные и кинетические характеристики

микробных культур?

2. Почему нахождение μ

max

невозможно экспериментальным путем?

3. Чем отличается характер воздействия на клетку факторов лимитиро-

вания и ингибирования роста?

ы: дать представление об основных методах получения целе-

вого продукта.

Завершающая стадия биотехнологического процесса — выделение це-

левого продукта. Эта стадия существенно различается в зависимости от то-

го, накапливается продукт в клетке, или он выделяется в культуральную

жидкость, или же продуктом является сама клеточная масса. Наиболее

сложно выделение продукта, накапливающегося в клетках. Для этого клетки

необходимо отделить от культуральной жидкости, разрушить (дезинтегриро-

вать) и далее целевой продукт очистить от массы компонентов разрушенных

клеток. Выделение продукта облегчается, если он высвобождается (экскрети-

руется) продуцентом в культуральную жидкость. Поэтому понятно стремле-

ние биотехнологов получить методами генетической инженерии промышлен-

ные штаммы микроорганизмов, экскретирующих возможно большее количе-

ство ценных продуктов.

Технология выделения и очистки в значительной степени зависит от

природы целевого продукта. Так, ферменты (протеазы, целлюлазы и т. д.)

выделяют путем осаждения органическими растворителями или сульфатом

аммония. Имеется возможность обойтись без их полной очистки, посколь-

ку в народном хозяйстве широко используют смешанные ферментные пре-

параты, содержащие несколько белков, близких по физико-химическим

свойствам. В то же время такие ферменты, как эндо- и экзонуклеазы, ли-

МОДУЛЬ 2. ПРОМЫШЛЕННАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Работа 2.6. Методы выделения и очистки целевого биотехнологического продукта



Введение в биотехнологию. Метод. указания по лабораторным работам

-35-

газы, требуют сложной многоэтапной очистки с применением тонких

методов препаративного разделения. Некоторые традиционные биотехноло-

гические процессы вообще не включают этап отделения продукта.

Первым этапом на пути к очистке целевого продукта является разделе-

ние культуральной жидкости и биомассы — сепарация. Существуют различ-

ные методы сепарации:

1) флотация, если клетки продуцента в биореакторе из-за низкой сма-

чиваемости накапливаются в поверхностных слоях жидкости;

2) фильтрация на пористой фильтрующей перегородке;

3) центрифугирование. Метод основан на осаждении взвешенных в

жидкости частиц с применением центробежной силы. Ценртрифугирование

требует более дорогостоящего оборудования, чем фильтрование. Поэтому

оно оправдывает себя, если: а) суспензия фильтруется медленно; б) постав-

лена задача максимального освобождения культуральной жидкости от со-

держащихся частиц; в) необходимо наладить непрерывный процесс сепа-

рации в условиях, когда фильтры рассчитаны только на периодическое

действие. Центрифугирование и фильтрация в некоторых производственных

процессах реализуются в комбинации — речь идет о фильтрационных цен-

трифугах. Широко применяют центрифуги, где разделение жидкой и

твердой фаз не связано с фильтрацией и основано лишь на центробежной

силе.

Следующим этапом получения целевого продукта является разрушение

клеток. Разрушение клеток (дезинтеграцию) проводят физическим, химиче-

ским и химико-ферментативным методами. Наибольшее индустриальное

значение имеет физическое разрушение: ультразвуком; с помощью вращаю-

щихся лопастей или вибраторов — метод, обычно используемый в пилотных и

промышленных установках; встряхиванием со стеклянными бусами; про-

давливанием через узкое отверстие под высоким давлением; раздавливани-

ем замороженной клеточной массы; растиранием в ступке; осмотическим

шоком; замораживанием — оттаиванием; сжатием клеточной суспензии с

последующим резким снижением давления (декомпрессия).

За дезинтеграцией клеток следует этап отделения фрагментов клеточ-

ных стенок. Используют те же методы, что и при сепарации клеток: цен-

трифугирование или фильтрацию. Однако применяют более высокоскорост-

ные центрифуги и фильтры с меньшим диаметром пор (часто мембранные),

чем при сепарации клеток. В большинстве биотехнологических процессов

клеточные стенки отбрасывают как балласт, но возможно и промышленное

получение компонентов клеточных стенок как целевого продукта.

Выделение целевого продукта из культуральной жидкости или го-

могената разрушенных клеток проводят путем его осаждения, экстракции

или адсорбции.

в включают хроматографию,

электрофорез, изотахофорез, электрофокусировку, основанные на принципах

экстракции и адсорбции. Разделение веществ путем хроматографии связано с

МОДУЛЬ 2. ПРОМЫШЛЕННАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Работа 2.6. Методы выделения и очистки целевого биотехнологического продукта



Введение в биотехнологию. Метод. указания по лабораторным работам

-36-

их неодинаковым распределением между двумя несмешивающимися фаза-

ми. Различают хроматографию на бумаге, пластинках, колонках. При хро-

матографии на бумаге или на пластинках одной из несмешивающихся фаз

служит движущийся растворитель, например бутанол, а другой, неподвиж-

ной фазой – волокна бумаги или частицы покрывающего пластинку силика-

геля или другого материала. При колоночной хроматографии подвижная

фаза – текущий через колонку растворитель, неподвижная – заполняющий ко-

лонку адсорбент, чаще всего гранулированный гель. Разделяемая смесь вво-

дится в контакт с подвижной и неподвижной фазами.

Колоночная хроматография допускает масштабирование – увеличение

размеров и пропускной способности. Она применяется в промышленных ус-

ловиях и имеет несколько разновидностей.

1. Ионообменная хроматография (рис. 2.9) – гранулы адсорбента, на-

пример карбоксиметилцеллюлозы, несут на себе заряженные группы, кати-

онные (NH

), анионные (SO

-2

), способные к захвату ионов противоположно-

го знака. Она применяется для выделения ионизированных соединений из

жидкости, а также для очистки нейтральных соединений от примесей ион-

ной природы. Одной из первых примененных в промышленных масштабах

ионообменных колонок была колонка с естественным ионообменником цео-

литом для смягчения воды, т. е. удаления из нее Са

и Mg

. Ионообменные

колонки с амберлитом широко применяют для отделения витамина В

Разделяемая смесь

смесь с вычетом

адсорбированных

ионов

а б

Рис. 2.9. Катионнообменная хроматография (схематизировано: изображено поверхностное

электростатическое взаимодействие с частицами): а , б – две стадии процесса

2. Метод «молекулярных сит», гель-хроматография, гель-фильтрация.

МОДУЛЬ 2. ПРОМЫШЛЕННАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Работа 2.6. Методы выделения и очистки целевого биотехнологического продукта



Введение в биотехнологию. Метод. указания по лабораторным работам

-37-

Хроматография, основанная на разделении веществ с различной молеку-

лярной массой и диаметром. Частицы адсорбента захватывают и удержива-

ют, скажем, только низкомолекулярные соединения, пропуская высокомо-

лекулярные (рис. 2.10).

а б

Рис. 2.10. Хроматография на основе «молекулярных сит (компоненты, размеры которых

соответствуют размерам пор или входов в поры адсорбента, задерживаются на колонке):

а, б — две стадии процесса

3. Аффинная хроматография – задерживается компонент, образующий

прочный комплекс с лигандом, фиксированным на частицах носителя

(рис. 2.11

а б

Рис. 2.11. Аффинная хроматография (в виде частиц различной формы

изображены молекулы с различными химическими структурами, из которых

только одна вступает в специфическое взаимодействие с частицами геля. Показано,

что в выемки на частицах геля входят лишь молекулы комплементарной формы):

а, б – две стадии процесса

Применяют агенты, специфически связывающие одно индивидуальное

вещество. Например, фермент очищают путем связывания на колонке, не-

сущей субстрат или специфический ингибитор.

МОДУЛЬ 2. ПРОМЫШЛЕННАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Работа 2.6. Методы выделения и очистки целевого биотехнологического продукта



Введение в биотехнологию. Метод. указания по лабораторным работам

-38-

Аффинная хроматография может обеспечить полную очистку продукта

из сложной многокомпонентной смеси – культуральной жидкости, экстракта

клеток – в одну стадию, в то время как более традиционные методы осаж-

дения и ионообменной хроматографии требуют многоэтапной очистки, со-

пряженной с большими затратами труда и времени. Определенные неудобства

вызывает относительная дороговизна материалов для аффинной хромато-

графии, в частности, веществ, используемых в качестве лигандов. Проблемой

является также быстрый выход колонки из строя при пропускании через нее

смесей, компоненты которых забивают промежутки между гелевыми части-

цами. Поэтому в производственных условиях колонки используются в перио-

дическом, а не непрерывном режиме.

После пропускания через колонку порции культуральной жидкости, из

которой выделяют продукт, частицы геля подвергают очистке. Методы очи-

стки основаны на: а) использовании гелевых частиц, превышающих по плот-

ности конгломераты веществ, закупоривающих колонку: различие в плотно-

сти позволяет очистить гель путем его избирательного осаждения или про-

точной промывки, уносящей только загрязняющие частицы; б) придании

частицам геля магнитных свойств, что позволяет провести их очистку в гра-

диентном магнитном поле; в) упаковке частиц геля в виде ленты, покрытой

тонкоячеистой оболочкой: лента вращается и проходит попеременно через

жидкость с неочищенным продуктом и через буферный раствор, в который

переходят загрязняющие примеси.

Масштабирование процесса аффинной хроматографии ограничивается

разрушением структуры геля и уносом его частиц током жидкости. Это, в част-

ности, обусловлено тем, что в широких колонках для крупномасштабной очи-

стки продуктов стенки колонки уже не служат опорой для частиц геля, увле-

каемых жидкостью. Увеличение высоты колонки приводит к пропорциональ-

ному возрастанию сил, разрушающих нижние слои геля. Помимо этого, для по-

вышения эффективности и степени разделения близких по свойствам соедине-

ний целесообразно применять мелкие частицы геля (менее 1 мкм в поперечни-

ке), но именно такие частицы легче всего увлекаются током жидкости. В по-

следние годы изыскивают средства укрепления гелей для крупномасштабной

аффинной хроматографии. Частицы агарозы – наиболее перспективного мате-

риала для гелей – предполагают укреплять путем сшивок.

Наряду с аффинной хроматографией, называемой также аффинной

адсорбцией в геле, для крупномасштабного отделения и очистки продуктов

биотехнологических процессов предполагают применять аффинную преци-

питацию и аффинное разделение. При аффинной преципитации лиганд

прикрепляют к растворимому носителю. При добавлении смеси, содержащей

соответствующий белок, образуется его комплекс с лигандом, который

выпадает в осадок сразу после его формирования или после дополнения

раствора электролитом. Аффинное разделение основано на применении сис-

темы, содержащей два водорастворимых полимера. Один из полимеров, на-

пример полиэтиленгликоль, несет специфические лиганды. Другой полимер,

например высокомолекулярный декстран, обладает сродством к остальным,

МОДУЛЬ 2. ПРОМЫШЛЕННАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Работа 2.6. Методы выделения и очистки целевого биотехнологического продукта



Введение в биотехнологию. Метод. указания по лабораторным работам

-39-

примесным компонентам. Так, содержащиеся в разделяемой смеси белки,

нуклеиновые кислоты, фрагменты клеточных структур предпочитают более

полярный декстран, тогда как целевой продукт, скажем, фермент, накапли-

вается «в сетях» полиэтиленгликоля, несущего молекулы лиганда (субстрата,

кофактора, ингибитора). Аффинное разделение представляет собой наиболее

высокоэффективный из аффинных методов очистки.

В качестве иллюстрации методов колоночной хроматографии будем

использовать метод гель-фильтрации образцов полимера, выделенного из

биомассы водородных бактерий.

1. Полигидроксибутират, выделенный из биомасса R. eutrophus B-5786;

2. Система ВЭЖХ «Бриз» с ручным инжектором и

рефрактометрическим детектором для анализа молекулярно-массовых

распределений полимеров;

3. Набор полистеролов для калибровки.

1. Приготовить 0,1 % раствор полимера в хлороформе;

2. Приготовить 0,1 % раствор полистерола с разной молекулярной массой;

3. Приготовить элюенты;

4. Включить систему ВЭЖК и задать программу хроматографирования;

5. Ввести через специальный порт 10 мкл стандартного раствора и дать

команду «старт» для проведения хроматографирования;

6. После завершения хроматографирования стандартов записать пробу

полимера;

7. Провести расчеты хроматограмм в соответствии с заданной калибровкой;

8. Оформить результаты в виде графика распределения молекулярных

масс полимера.

Вопросы:

1. Какие основные методы сбора биомассы вы знаете? Дайте краткую

характеристику этим методам.

2. Как можно разрушить биомассу и отделить осколки клеток от супернатан-

та?

3. Какие основные приемы выделения целевого продукта?

4. Чем отличается аффинная хроматография от гель-фильтрации?

(

)

ы: освоение метода определения общего азота в бактериаль-

ной биомассе (на примере штамма R. eutrophus B-5786).

МОДУЛЬ 2. ПРОМЫШЛЕННАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Работа 2.7. Методы анализа содержания основных (общий азот, белок)



Введение в биотехнологию. Метод. указания по лабораторным работам

-40-

Кривая роста – это суммарная запись истории роста культуры. Этого не

всегда достаточно для того, чтобы можно было предвидеть и изменить по

желанию состояние клеток. Изменения биохимических свойств клеток по хо-

ду роста представляются не менее важным моментом для оценки возможно-

сти получения того или иного продукта с помощью микробных клеток.

В фазе активного роста бактерии синтезируют преимущественно азотсо-

держащие вещества – белки и нуклеиновые кислоты. По мере старения культу-

ры синтез этих веществ замедляется и накапливаются запасные вещества. По-

этому уровень общего азота в клетке отражает степень активности культуры,

что делает необходимым определение биохимического состава культуры в про-

цессе роста. Содержание общего азота обычно определяется по Кьельдалю. Так

как на долю азота в белке приходится 16 %, то данные, полученные по этому

методу, легко пересчитать на белок. Количество белка в клетках можно опреде-

лить непосредственно по методу Лоури, пользуясь реактивом Фолина, который

дает цветную реакцию с тирозином и триптофаном.

- предварительно высушенная биомасса R. eutrophus B-5786, ото-

бранная из фазы активного роста и стационарной фазы роста;

- весы аналитические;

- электрическая плитка или песочная баня;

- термостойкие пробирки диаметром 2 см и высотой 20 см с

точной меткой 40 мл;

- штативы;

- фотоэлектроколориметр;

- мерные колбы емкостью 1 л, 100 мл и 50 мл;

- градуированные пипетки;

- H

концентрированная;

- перекись водорода 30 %-ная;

- 50 %-ный раствор сегнетовой соли;

- реактив Несслера, лакмусовая бумага;

- ГСО для определения азота.

1. На аналитических весах отвешивают 40 мг тонкоразмолотой био-

массы и переносят в термостойкую пробирку диаметром около 2 см, вы-

сотой 20 см и емкостью 40 мл (с точной меткой).

2. В пробирки приливают по 3 мл концентрированной серной ки-

слоты и по 0,5 мл 30 %-ной перекиси водорода и помещают в баню с

песком, установленную на электроплитке. Минерализацию проб проводят

при температуре около 400 °С. Для ускорения минерализации органиче-

ских веществ через 1 ч после начала кипения в пробирки осторожно добав-

ляют еще по 0,5 мл перекиси водорода. Нагревание продолжают до пол-

ного обесцвечивания содержимого пробирок.