Волова Т.Г. Введение в биотехнологию. Методические указания по лабораторным работам

Подождите немного. Документ загружается.

МОДУЛЬ 3. ИНЖЕНЕРНАЯ ЭНЗИМОЛОГИЯ

Работа 3.2. Методы детекции ферментативной активности



Введение в биотехнологию. Метод. указания по лабораторным работам

-51-

измерения активности используют манометрические методы с использова-

нием аппарата Варбурга. Примером таких реакций являются реакции окисле-

ния (поглощение кислорода), декарбоксилирования (выделение CO

) и т.д.

Когда в процессе реакции образуются кислые продукты, ее скорость можно

определить титрованием: количество образующейся кислоты определяют по

количеству щелочи, пошедшему на ее нейтрализацию. Особое место зани-

мают спектрофотометрические методы детекции ферментативной активно-

сти. Они применимы, когда в результате ферментативной реакции происхо-

дит образование продукта или расход субстрата, которые поглощают свет

определенной длины волны, как в видимом, так и в ультрафиолетовом диапа-

зоне спектра. Эти методы имеют ряд преимуществ – не требуют много вре-

мени для проведения анализа, обладают высокой чувствительностью, позво-

ляют использовать для измерений малые количества образца и проводить не-

прерывное наблюдение за ходом реакции. Они получили широкое примене-

ние при изучении окислительных ферментов, в реакции которых задейство-

ваны никотинамидные коферменты (НАД или НАДФ). В восстановленном

состоянии они имеют полосу поглощения при 340 нм, в окисленном этой по-

лосы нет. Таким образом, по скорости уменьшения (или увеличения) интен-

сивности этого поглощения определяют скорость ферментативной реакции.

Спектрофотометрию можно использовать не только когда непосредст-

венно изучаемая реакция сопровождается изменением оптической плотности.

Часто не обладающие оптическим поглощением продукты являются субстра-

тами для сопряженных ферментативных реакций, конечный продукт которых

имеет характерное поглощение на определенной длине волны. Таким обра-

зом, активность исследуемого фермента определяется опосредованно – по

продукту реакции сопряженного фермента. Сопряженные ферменты, естест-

венно, не должны лимитировать скорость реакции исследуемого фермента.

Очень просто определять активность ферментов, одним из продуктов реак-

ции которых является квант света. Это так называемые биолюминесцентные

и хемилюминесцентные реакции. Для измерения генерируемого светового

потока используют фотометры.

Есть ферменты, определение активности которых можно проводить

разными методами. Например, пероксидаза хрена катализирует реакцию пе-

роксидазного окисления разлиных субстратов. Продукты окисления облада-

ют поглощением в видимой области, причем в зависимости от строения мо-

лекулы продукта они поглощают в разных областях спектра (например,

окисленный о-фенилендиамин – при 490 нм, 5-аминосалициловая кислота –

при 450 нм и т.д.). Известны и используются субстраты пероксидазы, в ре-

зультате окисления которых образуется квант света. В этом случае имеет ме-

сто принципиально другой – хемилюминесцентный сигнал – и активность

фермента определяют по уровню генерируемого светового потока.

В рамках данной работы предлагается провести: А) спектрофотометри-

ческое определение активности щелочной фосфатазы и Б) определение био-

люминесцентной активности Са

– активируемого фотопротеина обелина.

МОДУЛЬ 3. ИНЖЕНЕРНАЯ ЭНЗИМОЛОГИЯ

Работа 3.2. Методы детекции ферментативной активности



Введение в биотехнологию. Метод. указания по лабораторным работам

-52-

Щелочная фосфатаза – это фермент, катализирующий гидролиз слож-

ноэфирной связи в фосфомоноэфирах. Одним из его субстратов является п-

нитрофенилфосфат, который гидролизуется по схеме.

N O

+ H

N OH

HO P

п-нитрофенилфосфат п-нитрофенол

Раствор п-нитрофенилфосфата не имеет окраски, а получаемый при

гидролизе п-нитрофенол поглощает свет в видимой области спектра (400–420

нм). Это позволяет определять кинетические параметры реакции спектрофо-

тометрическим методом.

Са

– активируемый фотопротеин обелин представляет собой устойчивый

фермент-субстратный комплекс из апобелка и субстрата – пероксицелентеразина.

В присутствии ионов кальция практически мгновенно развивается реакция декар-

боксилирования, одним из продуктов которой является квант света.

)

1. Два раствора щелочной фосфатазы (в 0,05 М глициновом буфере рН

10, содержащем 5х10

-4

М MgSO

) с разной концентрацией. (Хранить в ван-

ночке со льдом);

2. 0,005 М раствор п-нитрофенилфосфата в 0,05 М глициновом буфере

с рН 10, содержащем 5х10

-4

М MgSO

(раствор «А»);

3. 0,02 М раствор NaOH;

4. Термостат;

5. Секундомер;

6. Спектрофотометр и кварцевые кюветы;

7. Стеклянные пробирки;

8. Набор автоматических пипеток и наконечники к ним;

9. Ванночка со льдом для хранения фермента.

1. В пробирку внести 4,5 мл раствора «А» и поместить ее в термостат

(30

С) на 5–10 мин (реакционная смесь). Приготовить 4 пробирки с 9 мл 0,02

М раствора NaOH. Пометить пробирки надписями – 2, 5, 10, 15 мин.

2. В реакционную смесь внести 0,5 мл раствора фермента, одновремен-

но включив секундомер. Смесь инкубировать в термостате

(30

С).

щел. фосфатаза

МОДУЛЬ 3. ИНЖЕНЕРНАЯ ЭНЗИМОЛОГИЯ

Работа 3.2. Методы детекции ферментативной активности



Введение в биотехнологию. Метод. указания по лабораторным работам

-53-

3. Через 2, 5, 10, 15 мин из реакционной смеси отбирать аликвоты по 1

мл и вносить их в пробирки со щелочью с соответствующей маркировкой.

Тщательно перемешать эти растворы. Замерить оптическую плотность (D

400

)

полученных щелочных растворов с помощью спектрофотометра в кюветах с

толщиной слоя 1 см. Измерения проводить против контрольного раствора

(содержит все компоненты реакционной смеси без фермента, т.е. 0,5 мл рас-

твора «А» и 4,5 мл 0,02 М NaOH).

4. Построить график изменения оптической плотности от времени и

определить скорость ее изменения в начальный момент времени.

Скорость реакции V подсчитать по формуле, учитывая коэффициент

молярной экстинкции п-нитрофенола при 400 нм, равный 15,2⋅10

D t

= ⋅

⋅

15210

400

где 10 – коэффициент разбавления реакционной смеси раствором щелочи при

остановке реакции.

)

1. Два раствора фотопротеина обелина разной концентрации;

2. Раствор для измерения активности обелина (50 мМ Трис HCl pH 8,8,

10 мМ ЭДТА);

3. Раствор CaCl

(100 мМ, в 50 мМ Трис HCl pH 8,8);

4. Биолюминометр и кюветы для измерений к нему;

5. Самописец для регистрации сигнала;

6. Пластиковые пробирки Эппендорф (1,5 мл);

7. Набор автоматических пипеток и наконечники к ним.

1. Поместить в кювету для измерений 500 мкл раствора для измерений.

2. Внести 5 мкл раствора обелина и поместить кювету в люминометр,

закрыть кюветный блок.

3. Внести в кювету 250 мкл раствора CaCl

коротким впрыском.

4. Определить величину сигнала, учитывая настройки люминометра и

самописца.

5. Определить концентрацию фотопротеина в предложенных растворах

(в мг/мл), используя следующие данные: 1мВ = 10

кванта/сек; удельная ак-

тивность 1 мг обелина = 6,6 х 10

кванта/сек.

Примечание. Если при измерении активности наблюдается зашкалива-

ние прибора даже при самой грубой чувствительности, рекомендуется раз-

вести белок раствором для измерений и затем учесть это разведение при про-

ведении расчетов.

МОДУЛЬ 3. ИНЖЕНЕРНАЯ ЭНЗИМОЛОГИЯ

Работа 3.2. Методы детекции ферментативной активности



Введение в биотехнологию. Метод. указания по лабораторным работам

-54-

1. Какие методы детекции ферментативной активности вы знаете? От

чего зависит их выбор?

2. Что необходимо учитывать при измерении активности фермента в

сыром экстракте спектрофотометрическими методами?

3. Если активность фермента определяется спектрофотометрически и

имеется возможность использовать несколько различных субстратов – каки-

ми критериями руководствуются при выборе того или иного субстрата?

4. Какие преимущества имеют биолюминесцентные методы измерения

активности?

5. Каким образом надо проводить измерения активности в разных об-

разцах, чтобы ее значения отражали, прежде всего, содержание фермента?

6. Что может означать резкое (непропорциональное) увеличение актив-

ности фермента после проведения очередной стадии фракционирования?



Введение в биотехнологию. Метод. указания по лабораторным работам

-55-

Лабораторные работы не предусмотрены.



Введение в биотехнологию. Метод. указания по лабораторным работам

-56-

ь – дать представление о возможностях и границах биотехнологии

для защиты окружающей среды.

1. Ознакомление с возможностями биотехнологии для решения задач

детоксикации ксенобиотиков;

2. Дать основные понятия и принципы конструирования экологически

безопасных для биосферы биопрепаратов.

: обучение принципам иммобилизации клеток микроорга-

низмов методом механического захвата (включения в гели разных типов).

Иммобилизация – это процесс прикрепления биологических агентов

(ферментов, клеток) к поверхности природных или синтетических материалов,

включение их в полимерные материалы, полые волокна и мембранные капсу-

лы, поперечная химическая сшивка. Принципы этих технологий в настоящее

время получили широкое развитие в связи с новым направлением биотехноло-

гии «Инженерная энзимология». При иммобилизации ферментов происходит

стабилизация каталитической активности, иммобилизованный фермент,

имеющий ограниченную возможность для конформационных перестроек, бы-

стрее растворимого находит кратчайший путь к функционально активной

конформации. Это позволяет организовывать на базе иммобилизованных фер-

ментов эффективные биотехнологические процессы многократного периоди-

ческого, а также непрерывного действия с использованием принципа взаимо-

действия подвижной и неподвижной фаз.

Принципы иммобилизации ферментов все более широко используются в

настоящее время для иммобилизации клеток, предназначенных для ряда био-

технологических процессов, – биоорганического синтеза, детекции ряда со-

единений, деградации и связывания токсикантов.

Известны различные методы иммобилизации: адсорбционные методы

и методы химического связывания на поверхности, методы механического

включения или захвата, методы химического присоединения (рис. 5.1

МОДУЛЬ 5. БИОТЕХНОЛОГИЯ И ПРОБЛЕМЫ ЗАЩИТЫ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

Работа 5.1. Иммобилизация микробных клеток



Введение в биотехнологию. Метод. указания по лабораторным работам

-57-

B Г

Рис. 5.1. Основные методы иммобилизации: А – абсорбция на крупнопористом носителе;

Б – ковалентное связывание; В – адсорбция; Г – поперечная сшивка; Д – включение в гель

Методы иммобилизации путем адсорбции основаны на фиксировании

фермента на поверхности различных материалов – неорганических (силика-

гель, пористое стекло, керамика, песок, обожженная глина, гидроокиси тита-

на, циркония, железа) и органических (хитин, целлюлоза, полиэтилен, ионо-

обменные смолы, вспененная резина, полиуретан с ячеистой структурой).

Адсорбция – это самый простой метод иммобилизации ферментов на по-

верхности нерастворимых носителей. Процедура иммобилизации состоит в

смешивании в определенных условиях фермента с носителем и инкубации

смеси. Затем при помощи фильтрования и центрифугирования проводят от-

деление нерастворимого компонента смеси от растворимого. Адсорбция –

мягкий метод иммобилизации; недостаток данного метода – непрочность

связей. Поэтому при незначительном изменении условий среды (рН, темпе-

ратуры, ионной силы, концентрации продукта) возможна десорбция клеток с

поверхности носителя.

Наиболее распространенным методом иммобилизации клеток является

включение в полимерную структуру (метод механического захвата). Для это-

го применяют различные материалы: альгинат, желатину, каррагинан, колла-

ген, хитин, целлюлозу, полиакриламид. Взвесь клеток смешивают с раство-

ром мономеров носителя. Далее создают условия для процесса полимериза-

ции, в ходе которого происходит механическое включение клеток в структуру

носителя. Важным моментом является равномерность распределения клеток в

объеме носителя и однородность получаемых агрегатов. Техника включения

зависит от природы и свойств используемого материала, образуемые при этом

биосистемы имеют вид гранул, волокон, полимерных сеток, пленок и т.п.

На практике для иммобилизации клеток широко применяют полиакри-

ламидный гель (ПААГ), клетки вносят в раствор мономера (N, N

метилендиакриламида). Далее формируется гель в виде блока. Монолитный

гель измельчают, придавая частицам форму кубиков желаемого размера. При

использовании желатины или агар-агара вначале подогревают их растворы,

затем охлаждают и вносят фермент. В процессе последующего охлаждения

происходит формирование геля. Полимеризация альгината происходит в при-

сутствии некоторых катионов. Поэтому на первом этапе смешивают растворы

МОДУЛЬ 5. БИОТЕХНОЛОГИЯ И ПРОБЛЕМЫ ЗАЩИТЫ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

Работа 5.1. Иммобилизация микробных клеток



Введение в биотехнологию. Метод. указания по лабораторным работам

-58-

фермента и мономеров этих полисахаридов, далее смесь с помощью дози-

рующего устройства вносят в раствор, содержащий ионы Ca

или Ba

(для

альгината) или Al

, Fe

, K

или Mo

(для каррагинана), при этом образуют-

ся сферические полимерные частицы в виде гранул.

Гели в зависимости от природы используемого полимерного материала

отличаются по ряду показателей. Например, гели ПААГ недостаточно проч-

ные, но этого можно избежать при использовании ПААГ, содержащего жест-

кую арматуру из керамики. При увеличении степени сшивки с целью прида-

ния большей прочности гелю возникают проблемы диффузионных затрудне-

ний. Альгинатные гели отличаются высокой прочностью и хорошими гидро-

динамическими свойствами, что не создает препятствий для притока к ак-

тивным центрам молекул ферментов субстрата и оттока образуемого продук-

та. При работе с альгинатом кальция важно отсутствие в иммобилизационной

системе хелатирующих агентов (фосфатов, цитратов), которые, связывая

кальций, разрушают структуру геля.

Клетки, иммобилизованные на поверхности или в порах носителя или

включенные в полимерный матриксы, используются в ряде процессов, преж-

де всего для очистки сточных вод, газовоздушных выбросов и т. п.

1. Биомасса СО-окисляющих микроорганизмов Seliberia carboxydohy-

drogena;

2. Лабораторная центрифуга, бокс-ламинар (или микробиологический бокс);

3. Альгинат, раствор MgSO

, акриламид в наборе с компонентами для

полимеризации и образования полиоакриламида (ПААГ), физиологический

раствор, стерильная среда Шлегеля;

4. Перистальтический насос-дозатор, магнитная мешалка ММ-3;

5. Колбы объемом 1 л, стаканы, шпатели, чашки Петри, скальпель;

6. Термостатируемая качалка (или лабораторная мешалка);

7. Газгольдер, газовая смесь «воздух:монооксид углерода= 80:20 %об;

8. Газоанализатор для детекции концентрации газов (CO, N

, O

1. Провести включение клеток с использованием двух матрик-

сов: альгината и ПААГ: бактериальную пасту ресуспендировать в 0,2

калий-фосфатном буфере при рН 7,0.

2. Приготовить 7 % раствор ПААГ.

3. В раствор ПААГ внести клетки в концентрации 0,1; 0,2; 0,4 и 0,6 г/мл (по

сырому веществу) и хорошо перемешать клетки и охладить до 1

С.

4. Охлажденную смесь клеток и раствора носителя разлить в чашки

Петри слоем 2 мм и выдерживать в течение 30 мин.

5. Сформированный гель измельчить, используя скальпель, получая

частицы в виде кубиков размером 2x2x2 мм.

МОДУЛЬ 5. БИОТЕХНОЛОГИЯ И ПРОБЛЕМЫ ЗАЩИТЫ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

Работа 5.1. Иммобилизация микробных клеток



Введение в биотехнологию. Метод. указания по лабораторным работам

-59-

6. Полученный препарат иммобилизованных клеток хранить в фосфат-

ном буфере в бытовом холодильнике.

7. Включение клеток в альгинат: смешать раствор мономера альгината

с клетками (0,5 г сырых клеток/мл).

8. Для формирования геля приготовить 0,1 М трис-HCl буфер при

рН 7,0 с добавлением 0,01 М раствора CaCl

9. Смесь, содержащую раствор мономера альгината и бактериаль-

ные клетки, при постоянном перемешивании на магнитной мешалке с

помощью перистальтического насоса дозировать в приемную ванную

(стеклянный стаканчик с раствором CaCl

2).

По мере прохождения капель

через толщу раствора под воздействием ионов магния происходит поли-

меризация альгната и формируются гранулы диаметром 2,0–2,5 мм.

10. Полученный препарат иммобилизованных клеток хранить в фосфат-

ном буфере в бытовом холодильнике.

1. В чем специфика конструкции и методов применения биопрепаратов

и биотехнологий для детоксикации ксенобиотиков?

2. Каковы особенности техники иммобилизации микробных клеток,

предназначенных для связывания токсикантов?

3. В чем заключаются «узкие» места применения биопроцессов и био-

объектов для защиты окружающей среды от токсинных стоков и газовоздуш-

ных выбросов?

: обучение принципам использования иммобилизованных микроб-

ных клеток в биосистеме (биофильтр с омываемым слоем) для связывания

токсикантов.

Проблема борьбы с загрязнением воздушного бассейна в условиях воз-

растающей технологической деятельности приобретает все большую остро-

ту. В воздухе больших промышленных городов содержится огромное коли-

чество вредных веществ. При этом концентрация многих токсикантов пре-

вышает допустимые уровни. Основной вклад в загрязнение атмосферы вно-

сят предприятия нефтеперерабатывающей, химической, пищевой и перераба-

тывающей промышленности, а также большие сельскохозяйственные ком-

плексы, отстойники сточных вод, установки по обезвреживанию отходов.

Среди этих веществ –

органические (ароматические и непредельные углево-

дороды, азот-, кислород-, серо- и галогенсодержащие соединения) и неорга-

нические вещества (сернистый газ, сероуглерод, окислы углерода, аммиак,

хлорводород, галогены). В воздушных бассейнах больших промышленных

МОДУЛЬ 5. БИОТЕХНОЛОГИЯ И ПРОБЛЕМЫ ЗАЩИТЫ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

Работа 5.2. Принцип работы биофильтра с омываемым слоем.



Введение в биотехнологию. Метод. указания по лабораторным работам

-60-

городов присутствуют десятки различных соединений, в том числе дурно-

пахнущие, способные даже в незначительных концентрациях представлять

угрозу для здоровья, а также вызывать у людей чувство дискомфорта.

Для очистки воздуха применяют различные методы – физические, хи-

мические и биологические, однако уровень и масштабы их использования в

настоящее время чрезвычайно далеки от требуемых. Среди применяемых фи-

зических методов – абсорбция примесей на активированном угле и других

поглотителях, абсорбция жидкостями. Наиболее распространенными хими-

ческими методами очистки воздуха являются озонирование, прокаливание,

каталитическое дожигание, хлорирование. Биологические методы очистки

газовоздушных выбросов начали применять сравнительно недавно и пока в

ограниченных масштабах.

Биологические методы очистки воздуха базируются на способности

микроорганизмов разрушать в аэробных условиях широкий спектр веществ и

соединений до конечных продуктов, СО

и Н

О.

Для биологической очистки воздуха применяют три типа установок:

биофильтры, биоскрубберы и биореакторы с омываемым слоем.

Рабочим телом биореактора с омываемым слоем являются иммоби-

лизованные микроорганизмы. Биослой реактора представляет собой гра-

нулы с иммобилизованными микробными клетками. Этот слой омывает-

ся водой, содержащей необходимые для развития клеток минеральные

вещества. Загрязненный воздух проходит через него, при этом вещества,

подлежащие деструкции, диффундируют в водную пленку, покрываю-

щую частицы биокатализатора, и далее окисляются микроорганизмами.

Скорость деструкции может лимитироваться скоростью диффузии ве-

ществ из газовой фазы в жидкую, а также скоростью протекания реакций

в микробных клетках. Скорость диффузии, в свою очередь, зависит от

природы токсических веществ и их концентраций. Стационарный режим

биореактора с омываемым слоем после его запуска наступает через 5–10

дней. При использовании заранее адаптированных к очищаемым веще-

ствам микроорганизмов этот срок может быть сокращен до нескольких

часов. Периодически, обычно раз в несколько месяцев, биослой очища-

ют от избытка биомассы и наполняют свежими гранулами. Эти установ-

ки наиболее перспективны для очистки воздуха. Они характеризуются

более высокой удельной производительностью (несколько тысяч кубо-

метров очищаемого воздуха в час). Такие малогабаритные установки

очень эффективны для очистки воздуха предприятий интенсивного жи-

вотноводства. Степень очистки воздуха в реакторе с иммобилизованны-

ми на активированном угле микроорганизмами от ацетона, бутанола,

пропионового альдегида, этилацетата достигает 90 % при удельной про-

изводительности установки 10 000 ч

–1

Способность микроорганизмов усваивать для роста субстраты ток-

сической природы важна для понимания механизмов устойчивости биоло-

гических объектов к воздействию токсикантов, а также представляет

большой интерес в экологическом плане. Биокаталитический потенциал