Волова Т.Г. Введение в биотехнологию. Методические указания по лабораторным работам

Подождите немного. Документ загружается.

МОДУЛЬ 6. КЛЕТОЧНАЯ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

Работа 6.2. Экспрессия генов, клонированных в прокариотических системах.



Введение в биотехнологию. Метод. указания по лабораторным работам

-71-

2. Стерильная LB среда;

3. Стерильные колбы объемом 100 мл – 2 шт.; 1 л – 2 шт.;

4. Ампициллин (р-р , 200 мг/мл);

5. ИПТГ (изопропил –β-D-тиогалактопиранозид);

6. Микробиологический бокс;

7. Термостатированный шейкер;

8. Фотоэлектроколориметр (ФЭК) и кюветы к нему;

9. Центрифуга с охлаждением и центрифужные стаканы к ней;

10. Весы для уравновешивания центрифужных стаканов;

11. Набор автоматических пипеток и наконечников к ним.

1. Подписать колбы для культивирования «Obe» и «proZZ-Obe».

2. В стерильных условиях внести в 100 мл колбы по 20 мл стерильной

LB-среды, раствор ампициллина до конечной концентрации 200 мкг/мл и 2–3

среднего размера колонии соответствующих бактерий. Инкубировать при

С при активном перемешивании до плотности Д

590

= 0,5–0,6. Оптическую

плотность измерять через каждые 45–60 мин с помощью ФЭКа против ис-

ходной среды. Пробу отбирать стерильными наконечниками.

4. Полученную культуру поместить в холодильник до следующего ут-

ра. Отцентрифугировать клетки с помощью центрифуги К-23 (3–4 тыс.

об/мин,

С, 15 мин).

5. В колбы объемом 1 л с 200 мл стерильной LB-среды внести раствор

ампициллина до конечной концентрации 200 мкг/мл. Стерильно перенести

клетки в эти колбы, суспендируя их свежей стерильной LB-средой.

6. Инкубировать при 37

С при активном перемешивании. Следить за

ростом клеток, измеряя оптическую плотность ОД

590

против исходной среды

через каждый час.

7. При плотности ОД

590

= 0,6–0,8 отобрать по 1 мл культуры и отцен-

трифугировать на микроцентрифуге. Хранить образец клеток до индукции

при –20

С. Провести индукцию транскрипции рекомбинантного белка. Для

этого в колбы добавить сухую навеску ИПТГ (до концентрации 100 мг/л).

8. Продолжить культивирование еще в течение трех часов, следить за

ростом как описано в п. 3. Отобрать аликвоту клеточной суспензии, равную

количеству клеток до индукции, отцентрифугировать и хранить образец, как

описано в п. 4.

9. Построить кривую роста оптической плотности Д

590

от времени.

10. Бактерии отделить центрифугированием, как описано в п.1.

11. Промыть клетки, ресуспендируя физраствором (0,9 % NaCl), и

вновь отцентрифугировать. Взвесить полученную клеточную пасту.

1. Для чего нужна регуляция экспрессии рекомбинантных белков?

МОДУЛЬ 6. КЛЕТОЧНАЯ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

Работа 6.2. Экспрессия генов, клонированных в прокариотических системах.



Введение в биотехнологию. Метод. указания по лабораторным работам

-72-

2. Какие регуляторные участки должны присутствовать в экспресси-

руемой плазмиде?

3. Ген экспрессируемого в Е.coli белка находится под промотором РНК

полимеразы фага Т7. Какие гены должны присутствовать в клетке-хозяине,

чтобы экспрессия была эффективной?

4. Каковы свойства клеток Е.coli BL21(DE3), которые вы использовали

для экспрессии рекомбинантных белков?

5. Опишите регуляторные механизмы экспрессии в системе рЕТ, поль-

зуясь рис.11. Нарисуйте схематически плазмиды для экспрессии апообелина

и химерного белка.

6. Что такое ИПТГ? Что происходит в трансформированных клетках

после его добавления в питательную среду?

7. В каких условиях производится культивирование трансформирован-

ных клеток Е.coli BL21(DE3)?



Введение в биотехнологию. Метод. указания по лабораторным работам

-73-

ь – формирование представлений о границах применимости и эф-

фективности биотехнологий для повышения продуктивности сельского хо-

зяйства.

: на примере освоения техники конструирования безопасных

форм пестицидов, включенных в резорбируемый полимерный матрикс, дать

основы методологии и техники сельскохозяйственной биотехнологии.

Биотехнология вносит большой вклад в повышение эффективности

сельскохозяйственного производства. Разработаны и успешно применяются

биотехнологические методы защиты растений от вредителей и возбудителей

болезней полезной биоты. Это различные подходы, влючающие: 1) выведение

сортов растений, устойчивых к неблагоприятным факторам; 2) химические

средства борьбы (пестициды) с сорняками (гербициды), грызунами (ратици-

ды), насекомыми (инсектициды), нематодами (нематоциды), фитопатоген-

ными грибами (фунгициды), бактериями, вирусами; 3) биологические средст-

ва борьбы с вредителями, использование их естественных врагов и парази-

тов, а также токсических продуктов, образуемых живыми организмами.

Биотехнология решает задачи повышения продуктивности сельскохозяйст-

венных культур, их пищевой (кормовой) ценности, задачу создания сортов

растений, растущих на засоленных почвах, в засушливых и заболоченных

районах.

Важное место в выведении новых сортов растений занимает метод

культивирования растительных клеток in vitro. Регенерируемая из таких кле-

ток «молодая поросль» состоит из идентичных по генофонду экземпляров,

сохраняющих ценные качества избранного клеточного клона. Клонирование

клеток с последующим их скринингом и регенерацией растений из ото-

бранных клонов рассматривают как важный метод сохранения и улучшения

древесных пород умеренных широт, в частности хвойных деревьев. Расте-

ния-регенеранты, выращенные из клеток или тканей меристемы, исполь-

зуют ныне для разведения спаржи, земляники, брюссельской и цветной ка-

пусты, гвоздик, папоротников, персиков, ананасов, бананов. С клонирова-

нием клеток связывают надежды на устранение вирусных заболеваний расте-

ний. Разработаны методы, позволяющие получать регенеранты из тканей

верхушечных почек растений. В дальнейшем среди регенерированных рас-

тений проводят отбор особей, выращенных из незараженных клеток, и вы-

браковку больных растений. Раннее выявление вирусного заболевания, не-

обходимое для подобной выбраковки, может быть осуществлено методами

иммунодиагностики, с использованием моноклональных антител или мето-

дом ДНК/РНК-проб. Предпосылкой для этого является получение очищен-

ных препаратов соответствующих вирусов или их структурных компонентов.

Клонирование клеток – перспективный метод получения не только но-

вых сортов, но и промышленно важных продуктов. При правильном под-

МОДУЛЬ 7. СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ



Введение в биотехнологию. Метод. указания по лабораторным работам

-74-

боре условий культивирования, в частности при оптимальном соотношении

фитогормонов, изолированные клетки более продуктивны, чем целые расте-

ния. Иммобилизация растительных клеток или протопластов нередко ведет к

повышению их синтетической активности.

Биологические удобрения применяют для обогащения почвы связан-

ным азотом. Большое распространение получили препараты нитрагин и

азотобактерин – клетки клубеньковых бактерий и азотобактера, к которым

добавляют стабилизаторы (мелассу, тиомочевину) и наполнитель (бентонит,

почву). Азотобактерин обогащает почву не только азотом, но и витаминами

и фитогормонами, гиббереллинами и гетероауксинами. Препарат фосфобак-

терин из Bacillus megaterium превращает сложные органические соедине-

ния фосфора в простые, легко усвояемые растениями. Фосфобактерин

также обогащает почву витаминами и улучшает азотное питание растений.

Большое значение биотехнология уделяет профилактике инфекцион-

ных заболеваний сельскохозяйственных животных с применением рекомби-

нантных живых вакцин и генно-инженерных вакцин-антигенов, ранней диаг-

ностике этих заболеваний с помощью моноклональных антител и

ДНК/РНК-проб.

Биологические методы и препараты занимают все более значимое ме-

сто не только для повышения плодородия почв, но также и для борьбы с вре-

дителями сельскохозяйственного производства и возбудителями болезней

культурных растений и домашних животных.

ы: конструирование экологически безопасных форм пести-

цидов с применением биоразрушаемых полимеров (полигидроксиалканоатов,

ПГА); исследование разрушаемости полимерного матрикса в почве.

Бурное развитие химии и переход сельского хозяйства на интенсивные

технологии привели к появлению и применению огромного разнообразия

химических веществ для борьбы с вредителями, сорняками и возбудителями

болезней культивируемых видов. В отличие от других загрязняющих ве-

ществ (радионуклиды, тяжелые металлы и др.) реальная опасность пестици-

дов не полностью осознана. Это объясняется тем, что пестициды – это сотни

действующих веществ и десятки тысяч препаратов. Методы анализа их в ок-

ружающей среде сложны и не всегда надежны. Отсутствие информации об

экотоксикологических свойствах пестицидов – главная причина их опасно-

сти, при этом долговременные экологические последствия применения пес-

тицидов не изучены. Используемые в большинстве случаев в виде порошков,

суспензий и эмульсий пестициды зачастую не обеспечивают адресную дос-

тавку препаратов, что ведет к их рассеиванию и последующей аккумуляции в

МОДУЛЬ 7. СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

Работа 7.1. Депонирование пестицидов в матрикс из разрушаемых биополимеров.



Введение в биотехнологию. Метод. указания по лабораторным работам

-75-

биосфере. Широкое применение пестицидов, к сожалению, не обеспечило

полную защиту сельскохозяйственных культур. Большое число насекомых и

сорняков остаются неконтролируемыми. Они продолжают наносить огром-

ный вред сельскому хозяйству. Одним из серьезных недостатков современ-

ных препаратов является аккумуляция в биосфере и приобретение нежела-

тельными организмами резистентности к ним. Пестициды, обладающие му-

тагенным и канцерогенным действием, попадая в организм человека с про-

дуктами питания, представляют угрозу для здоровья. Традиционное приме-

нение пестицидов вступило в противоречие с глобальной проблемой защиты

окружающей среды. Это вызывает необходимость поиска более эффектив-

ных средств и методов защиты полезной биоты, не оказывающих отрица-

тельного воздействия на человека и окружающую среду в целом. Новейшим

направлением исследований, ориентированных на снижение риска неконтро-

лируемого распространения ксенобиотиков в биосфере, является разработка

экологически безопасных препаратов нового поколения с адресным и кон-

тролируемым выходом активного начала за счет использования специальных

покрытий и/или матриксов из биоразрушаемых материалов. В последние

годы стали появляться работы по получению препаратов из полимерных ма-

териалов, нагруженных пестицидами.

Ключевым звеном для создания препаратов такого типа является нали-

чие адекватного материала, обладающего специальными свойствами, среди

которых обязательные: экологическая совместимость с окружающей средой

и глобальными биосферными круговоротными циклами, то есть разрушае-

мость, безопасность для живой и неживой природы, длительная (недели и

месяцы) сохраняемость в природной среде и контролируемая деструкция с

образованием нетоксичных продуктов; химическая совместимость с пести-

цидами, возможность переработки доступными способами, совместимыми с

технологиями изготовления этих препаратов.

1. Образец полимера;

2. Образец модельного пестицида (минеральная соль);

3. Шаровая мельница;

4. Весы;

5. Фарфоровая ступка;

6. Лабораторный пресс;

7. Микроскоп с фотоаппаратом;

8. Образцы почвы;

9. Пластиковые контейнеры;

10. Термостат.

1. Навеску полимера (5 г) подвегнуть размалыванию в шаровой мельнице.

2. Измельченный порошкообразный полимер развешать на 10 образцов

массой 20 мг.

МОДУЛЬ 7. СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

Работа 7.1. Депонирование пестицидов в матрикс из разрушаемых биополимеров.



Введение в биотехнологию. Метод. указания по лабораторным работам

-76-

3. Приготовить 10 навесок модельного препарата (NH

Cl) по 20 мг.

4. В фарфоровой ступке тщательно перемешать оба компонента.

5. Из полученной смеси на лабораторном прессе с использованием

пресс-формы спрессовать компакты в виде таблетки.

6. Произвести взвешивание образцов.

7.Определить рН и влажность почвы.

8. Приготовить навески почвы по 100 г и разместить в пластиковые

контейнеры.

9. В почве разместить полученные формы препаратов в виде таблетки.

10. Разместить приготовленные образцы (контейнеры с почвой с образ-

цами препаратов) в термостате при заданной температуре (25

С).

11. Ежедневно измерять и корректировать влажность почвы.

12. Периодически (еженедельно) в ходе занятий изымать на 3 контей-

нера для анализа состояния образцов препаратов (внешний вид, остаточная

масса), фиксировать фотографированием.

13. Результаты заносить в табл. 6.1.

14. По завершении эксперимента построить график изменения массы

формы (рис. 6.1

), определить скорость разрушения полимерного матрикса

(рис. 6.2) и период полураспада полимера в данных условиях:

V = M

исх

/М

… М

…М

и т. д.,

где V – скорость разрушения полимера (мг/сутки), М

исх

, М

и т. д. – масса об-

разцов.

Таблица 6.1

Дата

Длительность

этапа,

сут

Масса об-

разца

Скорость

разрушения

полимера,

г/сут

Период полу-

распада

МОДУЛЬ 7. СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

Работа 7.1. Депонирование пестицидов в матрикс из разрушаемых биополимеров.



Введение в биотехнологию. Метод. указания по лабораторным работам

-77-

% от исходного

Сутки

Рис. 7.1. Динамика уменьшения массы полимерных образцов

V, мг/сут

Сутки

Рис. 7.2. Динамика скорости биодеградации полимерного матрикса

как платформы адресной доставки пестицидов

1. В чем принципиальное отличие по способам применения и эффек-

тивности действия биопестицидов и биоинсектицидов от химических препа-

ратов?

2. Почему биоинсектициды исключают залповые выбросы препаратов в

среду?

3. Что является ключевым моментом для успеха конструирования и

применения биоинсектицидов и биогербицидов?



Введение в биотехнологию. Метод. указания по лабораторным работам

-78-

Лабораторные работы не предусмотрены.



Введение в биотехнологию. Метод. указания по лабораторным работам

-79-

К разделу 1

1. Биотехнология : в 8 сборниках / под ред. Н. Егорова, Н. Самуилова. –

М. : Высшая школа, 1987.

2. Биотехнология: принципы и применение / под ред. И. Хиггинса,

Д. Беста и Дж. Джонса. – М. : Мир, 1988.

3. Варфоломеев, С. Д. Биотехнология: Кинетические основы микро-

биологических процессов : учеб. пособие для биол. и хим. спец. вузов /

С. Д. Варфоломеев, С. В. Калюжный. – М. : Высшая школа, 1990.

4. Волова, Т. Г. Биосинтез на водороде / Т. Г. Волова. – Новосибирск :

Изд-во СО РАН, 2004.

5. Волова, Т. Г. Биотехнология / Т. Г. Волова. – Новосибирск : Изд-во

СО РАН, 2002.

6. Гусев, М. В. Микробиология / М.В. Гусев, Л. А. Минеева. – 3-е изд. –

М. : Изд-во МГУ, 1992.

7. Перт, С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов /

С. Дж. Перт. – М. : Мир, 1978.

8. Шлегель, Г. Г. Общая микробиология / Г. Г. Шлегель. – М. :

Наука, 1984.

К разделу 2

1. Биотехнология : в 8 сборниках / под ред. Н. Егорова и Н. Самуилова.

– М. : Высшая школа, 1987.

2. Биотехнология: принципы и применение / под ред. И. Хиггинса,

Д. Беста и Дж. Джонса. – М. : Мир, 1988.

3. Варфоломеев, С. Д. Биотехнология: Кинетические основы микро-

биологических процессов : учеб. пособие для биол. и хим. спец. вузов /

С. Д. Варфоломеев, С. В. Калюжный. – М. : Высшая школа, 1990.

4. Волова, Т. Г. Биотехнология / Т. Г. Волова. – Новосибирск : Изд-во

СО РАН, 2002.

5. Гапонов, К. П. Процессы и аппараты микробиологических произ-

водств / К. П. Гапонов. – М. : Легкая и пищевая промышленность,

1981.– 240 с.

6. Гусев, М. В. Микробиология / М. В. Гусев, Л. А. Минеева. – 3-е изд.

– М. : Изд-во МГУ, 2001.

7. Методы биохимического исследования растений. – Л. : Колос, 1972.

8. Перт, С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов /

С. Дж. Перт. – М. : Мир, 1978.

9. Плешиков, Б. П. Практикум по биохимии растений / Б. П. Плешиков.

– М. : Колос, 1976.

10. Скоупс, Р. Методы очистки белков / Р. Скоупс. – М. : Мир, 1985.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ



Введение в биотехнологию. Метод. указания по лабораторным работам

-80-

11. Соколов, В. Н. Аппаратура микробиологической промышленности /

В. Н. Соколов, М. А. Яблокова – Л. : Машиностроение, 1988. – 278 с.

К разделу 3

1. Биотехнология : в 8 сборниках / под ред. Н. Егорова и Н. Самуилова.

– М. : Высшая школа, 1987.

2. Иммобилизованные клетки и ферменты (Методы) / под ред.

Дж. Вудворда. – М. : Мир, 1988.

3. Иммобилизованные ферменты / под ред. И. В. Березина,

В. К. Антонова, К. Мартинека. – М. : Изд-во МГУ, 1976.

4. Скоупс, Р. Методы очистки белков / Р. Скоупс. – М. : Мир, 1985.

5. Химическая энзимология / под ред. И. В. Березина, К. Мартинека. –

М. : Изд-во МГУ, 1983. – 278 с.

К разделу 4

1. Бутенко, Р. Г. Клеточная инженерия / Р.Г. Бутенко, М. В. Гусев,

А. Ф. Киркин. – М. : Высшая школа, 1987.

2. Глик, Б. Молекулярная биотехнология. Принципы применения /

Б. Глик, Дж. Пастернак. – М. : Мир, 2002.

3. Клонирование ДНК (методы) / под ред. Д. Гловера. – М. : Мир, 1988.

4. Скоупс, Р. Методы очистки белков / Р. Скоупс. – М. : Мир, 1985.

5. Maxam, A. M. A new method of sequencing DNA / A. M. Maxam,

W. Gilbert // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1977. – V. 74. – P. 560–564.

6. Sanger, F. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors / F. Sanger,

S. Niclein, A.R. Coulson // Proc. Natl. Acad. Sci. USA – 1977. – V. 74. –

P. 5463–5467.

К разделу 5

1. Волова, Т. Г. Экологическая биотехнология: учеб. пособие для уни-

верситетов / Т. Г. Волова. – Новосибирск : Хронограф, 1997. – 141 с.

2. Волова, Т. Г. Биотехнология / Т. Г. Волова. – Новосибирск : Изд-во

СО РАН, 1999. – 252 с.

3. Кузнецов, А. Е. Научные основы экобиотехнологии / А. Е. Кузнецов,

Н. Б. Градова. – М. : Мир, 2006.

4. Экологическая биотехнология / под ред. К. Форстера и Д. Вейза. –

Л. : Химия, 1990.

К разделу 6

1. Волова, Т. Г. Экологическая биотехнология: учеб. пособие для уни-

верситетов / Т. Г. Волова. – Новосибирск : Хронограф, 1997. – 141 с.