Волова Т.Г. Введение в биотехнологию. Методические указания по лабораторным работам

Подождите немного. Документ загружается.

МОДУЛЬ 2. ПРОМЫШЛЕННАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Работа 2.7. Методы анализа содержания основных (общий азот, белок)



Введение в биотехнологию. Метод. указания по лабораторным работам

-41-

3. После окончания озоления пробирки выдерживают еще 15–20

мин для окончания разложения перекиси водорода. Затем в охлажденные

пробирки очень осторожно приливают воду – 10 мл.

4. Содержание пробирок нейтрализуют 10 %-ным раствором NaOH.

Конец нейтрализации определяют по посинению лакмусовой бумажки, не-

большую полоску которой помещают в пробирку.

5. Чтобы избежать появления опалесценции раствора, в колбы до-

бавляют по 1 мл 50 %-ного раствора сегнетовой соли и приливают по

2 мл реактива Несслера. Необходимо строго соблюдать порядок добавления

реактивов. Содержимое в пробирках тщательно перемешивают.

6. В результате реакции между аммиаком и реактивом Несслера рас-

твор окрашивается при малом содержании азота в желтый цвет, при более

высоком – в оранжевый. Растворы должны быть совершенно прозрачными.

Интенсивность окраски растворов определяют на фотоэлектроколориметре

с синим светофильтром.

7. Вычисление результатов. Содержание азота рассчитывают по ка-

либровочной кривой, для построения которой используют образцовый рас-

твор NH

CI или ГСО. При приготовлении этого раствора 0,382 г химически

чистого (х.ч.) перекристаллизованного NH

C1 растворяют в 1 л бидистил-

лированной воды и получают исходный раствор с содержанием 0,1 мг

азота в 1 мл. Из этого раствора путем десятикратного разведения готовят

образцовый раствор с содержанием 0,01 мг азота в 1 мл. Шкалу образцо-

вых растворов готовят со следующими концентрациями (мг азота в колбе

емкостью 50 мл): 0,01; 0,02; 0,04; 0,06; 0,08; 0,10; 0,15; 0,20; 0,25.

На занятиях используем готовую калибровочную кривую. Находим со-

держание общего азота в 40 мг биомассы и рассчитываем процент содержа-

ния азота в сухой биомассе. Для пересчета на белок, полученный результат

умножаем на коэффициент 2,5. Результаты анализов оформляем в виде таб-

лицы.

Таблица 2.5

Содержание общего азота и белка в биомассе бактерий, % сухого вещества

№ пробы

Оптическая

плотность

Результат по

калибровке

Мг на 40 мг

Общий азот

% сух. в-ва

Белок

% сух.

в-ва

1. Почему необходимо изучать биохимический состав микроорганизмов?

2. Каковы основные методы определения белковых компонентов клетки?

3. В чем заключаются принципы определения общего азота?

МОДУЛЬ 2. ПРОМЫШЛЕННАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Работа 2.7. Методы анализа содержания основных (общий азот, белок)



Введение в биотехнологию. Метод. указания по лабораторным работам

-42-

4. Какие отличия наблюдаются при определении общего азота в клет-

ках бактерий, отобранных в разные фазы роста?

(

)

ы: освоение методов определения полисахаров (А) и био-

полимеров-полигидроксиалканоатов (Б).

(

)

в. Реакция основана на взаимодействии са-

харов с антроновым реактивом, который образует синевато-зеленое ок-

рашивание со всеми растворимыми углеводами. Окрашиваемость раствора

определяется концентрацией сахаров. Это позволяет при определении угле-

водов использовать калибровочную кривую, составленную по глюкозе

для определения всех углеводов.

Метод дает возможность определять полисахара типа крахмала в

небольших концентрациях и пригоден для анализа бактериальных клеток.

1. Антроновый реактив (0,2 %-ный раствор антрона в концентриро-

ванной серной кислоте (200 мг в 100 см

);

2. 3 %-ный раствор HCl;

3. Насыщенный раствор уксуснокислого свинца;

4. Насыщенный раствор сернокислого натрия;

5. Термостойкие пробирки;

6. Мерные колбы на 100 мл;

7. Пипетки на 1, 5, 10 мл;

8. Водяная баня;

9. Фотоколориметр.

1. Взвесить на аналитических весах 100 мг измельченной высушен-

ной биомассы и поместить в пробирку.

2. Залить биомассу 20 мл 3 % соляной кислотой и гидролизовать на

кипящей водяной бане в течение 3 ч.

3. После гидролиза остудить пробирки и добавить 3 мл насыщен-

ного раствора уксусного кислого свинца для осаждения белков и 9 мл

насыщенного раствора сернокислого натрия для осаждения свинца.

4. Перенести содержимое пробирки в мерную колбу на 100 мл,

сполоснуть пробирки несколькими порциями дистиллированной воды,

собрать в мерную колбу и довести объем колбы водой до метки.

5. В отдельную пробирку отфильтровать раствор через фильтр

«синяя лента» и отобрать для анализа 1 мл раствора в чистую пробирку.

6. К 1 мл отфильтрованного раствора осторожно по стенке пробир-

ки добавить 5 мл антронового реактива (пробирки с пробой предвари-

МОДУЛЬ 2. ПРОМЫШЛЕННАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Работа 2.8. Методы анализа запасных (полисахара, биополимеры) клеточных макромолекул



Введение в биотехнологию. Метод. указания по лабораторным работам

-43-

тельно поставить в стакан с холодной водой или на лед) и провести ре-

акцию на кипящей водяной бане в течение 15 мин.

7. После окончания реакции пробирки остудить под струей холод-

ной воды и провести замер оптической плотности на фотоколориметре в

сантиметровой кювете при красном светофильтре против холостой про-

бы. Холостая проба готовится так: к 1 мл дистиллированной воды до-

бавляется 5 мл антронового реактива и кипятится вместе с пробами на

водяной бане.

8. Расчет содержания общих углеводов проводится по калибро-

вочному графику. Для построения калибровочной кривой используют

глюкозу. Исходный раствор – 100 мг глюкозы на 1 л воды. Из него де-

лается серия разведений от 10 до 100 мкг глюкозы в 1 мл.

Вычисления производят по формуле

Х = a x v x 100/н,

где а – количество сахара, найденное по калибровочной кривой; ν – объем

экстракта; н – навеска.

Результаты анализа оформить в виде табл. 2.6.

Таблица 2.6

Содержание полисахаров в биомассе бактерий, % сухого вещества

№ пробы

Оптическая

плотность

Результат по

калибровке

Мг на 100 мг

Полисахара %

сух. в-ва

(

)

(

)

о-

с-

й. Полигидроксиалканоаты относятся к резервным (запасным)

макромолекулам и образуются прокариотами при несбалансированном росте

или в стационарной фазе роста. В отличие от матричного синтеза белков

ПГА синтезируются в ходе сложного многоступенчатого биосинтетического

процесса, каждую стадию которого катализируют специфические ферменты.

Синтез ПГА в общих чертах сходен у различных микроорганизмов (Alcali-

genes, Azotobacter, Pseudomonas). Условия, обеспечивающие изменение на-

правления анаболизма клеток с белковой программы на синтез ПГА, опреде-

ляются окислительно-восстановительным состоянием цитоплазмы, внутри-

клеточной концентрацией пирувата и свободного КoA. Содержание этого за-

пасного полимера можно определить двумя методами: взвешиванием выде-

ленного из клеток полимеры – весовой метод; и хроматографическим мето-

дом после гидролиза биомассы.

МОДУЛЬ 2. ПРОМЫШЛЕННАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Работа 2.8. Методы анализа запасных (полисахара, биополимеры) клеточных макромолекул



Введение в биотехнологию. Метод. указания по лабораторным работам

-44-

1. H

концентрированная;

2. Абсолютный спирт;

3. Раствор бензойной кислоты в хлороформе (0,5 мг/мл);

4. Чистый полимер;

5. Аналитические весы;

6. Колбы со шливом;

7. Обратный холодильник;

8. Водяная баня с регулирующей системой нагрева;

9. Роторный испаритель;

10. Газовый хроматограф с масс-спектрометром и капиллярной колонкой;

11. Газ-носитель гелий с чистотой 99,999 %.

1. На аналитических весах взвешиваем 4–5 мг высушенной и растертой

биомассы бактерий и помещаем в колбочку со шлифом. Параллельно с про-

бой берем навеску чистого полимера (4–5 мг) и переносим ее в другую колбу.

2. К навескам биомассы и полимера приливаем 1 мл раствора бензой-

ной кислоты в хлороформе, 0,85 мл спирта и 0,15 мл серной кислоты.

3. Прикрепляем колбы к обратному холодильнику, открываем кран с хо-

лодной водой, который соединен с холодильником, опускаем колбы в водяную

баню, нагретую до 90

С. Гидролиз полимера проводим в течение 140 минут.

4. После того, как колбы остынут, снимаем их с холодильника, долива-

ем 0,5 мл дистиллированной воды, закрываем колбы стеклянными крышками

и оставляем в холодильнике для расслоения фаз. Нижнюю хлороформную

фазу используем для анализа.

5. Метиловые эфиры жирных кислот анализируем на газовом хромато-

графе с масс-спектрометром (GCD Plus, Hewlett Packard, USA). Отбираем

микрошприцем 1 мкл нижней фазы и через специальный порт вводим пробу

в колонку газового хроматографа. Условия хроматографирования: газ-

носитель – гелий, скорость – 1 мл/мин; температура ввода пробы – 220

С ;

начальная температура хроматографирования – 80

С, подъем температуры

до 230

С со скоростью 8

С в минуту; температура интерфейса – 250

С; ко-

лонка капиллярная НР-FFAP, длина 30 м, диаметр – 0,25 мм. Получаем хро-

матограмму, которую распечатываем, а результаты используем для подсчета

содержания полимера.

6. Рассчитываем содержание полимера в биомассе по соотношению

площадей пиков внутреннего стандарта (0,5 мг бензойной кислоты) и моно-

мера – гидроксибутирата, вводя коэффициент пересчета. Коэффициент пере-

счета (К) получаем из хроматограммы чистого полимера. Обычно он колеб-

лется от 5,85 до 6,3. Пусть А – площадь пика внутреннего стандарта, Б –

площадь пика мономера полимера, составляем пропорцию:

А – 0,5 мг;

Б – В мг, тогда В = К х Б х 0,5/А мг полимера в навеске (Н).

МОДУЛЬ 2. ПРОМЫШЛЕННАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Работа 2.8. Методы анализа запасных (полисахара, биополимеры) клеточных макромолекул



Введение в биотехнологию. Метод. указания по лабораторным работам

-45-

Находим содержание полимера в % к сухому веществу из пропорции:

В – Х %;

Н – 100 %, тогда Х % = В х 100/Н.

Результаты оформляем в табл. 2.7.

Таблица 2.7

Содержание полимера в биомассе бактерий, % сухого вещества

№ пробы

Навеска, мг

Полимер, % сух. в-ва

1. В каких условиях роста микроорганизмы синтезируют запасные вещества?

2. Какие основные запасные вещества содержат микроорганизмы?

3. В чем заключается принцип антронового метода?

4. К какому классу органических соединений относятся полигидрокси-

алканоаты?

5. Каковы основные этапы газо-хроматографического определения со-

держания полимера в бактериях? Перечислите их.



Введение в биотехнологию. Метод. указания по лабораторным работам

-46-

ь – практическое освоение основных методов работы по выделению

и очистке ферментных препаратов из бактериальных клеток.

Инженерная энзимология — новое научно-техническое направление,

основанное на принципах целого ряда областей современного естествозна-

ния, в первую очередь химической энзимологии, биохимии, химической тех-

нологии, а также инженерно-экономических дисциплин. Основная задача

инженерной энзимологии – разработка биотехнологических процессов, в ко-

торых используется каталитическое действие ферментов, как правило, выде-

ленных из состава биологических систем или находящихся внутри клеток,

искусственно лишенных способности расти. К инженерной энзимологии от-

носятся соответствующие научно-исследовательские и инженерные разра-

ботки, если они ставят своей целью: а) получение нового продукта; б) полу-

чение известного продукта, но лучшего качества; в) улучшение технико-

экономических показателей процесса по сравнению с аналогичными процес-

сами.

Ферменты и ферментативные системы традиционно применяются в са-

мых различных областях практической деятельности: в пищевой, фармацев-

тической, текстильной, кожевенной и других отраслях промышленности, в

медицине, сельском хозяйстве, органическом синтезе, химическом анализе и

т. д. Благодаря своей высокой специфичности ферменты давно применяются

в области аналитической химии. Применение иммобилизованных ферментов

способствует созданию методов «без-реагентного» анализа, позволяющих

проводить практически непрерывный анализ водных растворов органических

(а в ряде случаев и неорганических) соединений. Ферментные электроды

применяются в быстром автоматическом анализе многокомпонентных сис-

тем. Наконец, разработаны чувствительные ферментативные методы с ис-

пользованием термисторов, в том числе и с «ферментными термисторами».

Инженерная энзимология относится к разряду новейших и высоких

биотехнологических процессов. Для работы с ферментами необходимо нали-

чие специальной дорогостоящей аппаратуры и реагентов, а также квалифи-

цированных специалистов. Особые трудности связаны с необходимостью

применения сложных процедур для выделения ферментов из биологического

материала (микробных биомасс, природных материалов растительного и жи-

вотного происхождения), последующей очистки и стабилизации фермента-

тивной активности.

МОДУЛЬ 3. ИНЖЕНЕРНАЯ ЭНЗИМОЛОГИЯ



Введение в биотехнологию. Метод. указания по лабораторным работам

-47-

(

)

ы: знакомство с методами выделения и очистки ферментов из

различных источников; выделение рекомбинантных апообелина и зеленого

флюоренцентного белка (GFP) из биомассы E.сoli.

Процедура получения препаратов различных ферментов включает в се-

бя две основных стадии – выделение и очистку. Под выделением подразуме-

вают получение обогащенного экстракта целевого белка из клеток (бактери-

альных, растительных или животных). Как правило, эти экстракты содержат

достаточно много различных примесей. Для получения препарата фермента

высокой чистоты производят дополнительную очистку с использованием

различных, в основном хроматографических, методов. На стадии выделения

проводят разрушение клеточной стенки, и методы, которые для этого приме-

няют, естественно, зависят от природы клеток, а также локализации целевого

фермента в клетке. Так, животные и растительные клетки чаще всего разру-

шают механически гомогенизаторами с металлическими ножами. Бактери-

альные клетки разрушают механически (на специальной установке – френч-

прессе – клеточная паста продавливается под высоким давлением через мик-

ронную щель, образованную стальными лезвиями), с помощью ультразвуко-

вой обработки, процедурой замораживания – оттаивания, ферментативной

обработкой (например, лизоцимом). Для разрушения дрожжевых клеток эф-

фективнее всего использовать кратковременную тепловую обработку в ще-

лочных условиях.

Экстракцию белков из полученного гомогената проводят водой, но ча-

ще всего – буферными растворами, содержащими необходимые добавки и

имеющими значения рН, которые обеспечивают максимальную стабильность

целевого белка. Полученный экстракт наряду с интересующим ферментом

всегда содержит ряд примесей белковой и небелковой природы. Чтобы изба-

виться от балластных примесей, используют различные способы фракциони-

рования, выбор которых зависит от свойств целевого белка. Например, если

фермент термостабилен, даже слабая термообработка позволит избавиться от

всех термолабильных белков в смеси; если фермент устойчив в кислой среде

– подкисление раствора поможет избавиться от балластных белков, денату-

рирующих при этих условиях и т. д.

Очень часто для обогащения экстракта целевым ферментом использу-

ют такие приемы, как солевое осаждение, осаждение органическими раство-

рителями, избирательную абсорбцию. Следует заметить, что изменения па-

раметров среды производят очень постепенно, не используя сильных кислот

и щелочей. Все процедуры проводят на холоде.

Результаты очистки рекомендуется суммировать в табл. 3.1

МОДУЛЬ 3. ИНЖЕНЕРНАЯ ЭНЗИМОЛОГИЯ

Работа 3.1. Выделение ферментов (на примере светящихся белков)



Введение в биотехнологию. Метод. указания по лабораторным работам

-48-

Таблица 3.1

Объем

раствора

Актив-

ность в 1

мл

Общая

актив-

ность

Белок,

мг

Удельная

актив-

ность

Степень

очистки

Выход,

% активно-

сти от исх.

Процедура выделения целевых ферментов существенно упрощается,

когда речь идет о получении рекомбинантных белков. Используемые в на-

стоящее время экспрессирующие системы на базе бактериальных клеток

E.coli позволяют получать большие количества целевого белка – иногда его

содержание достигает более 50 % от всех клеточных белков. При такой вы-

сокой экспрессии рекомбинантных белков, как правило, клетки-хозяева «па-

куют» их в виде нерастворимых частиц, так называемых «телец-включений».

Выделение белков из телец-включений имеет ряд преимуществ: а) в них ре-

комбинантный белок находится практически в чистом виде; б) находясь в не-

растворенном виде, он практически не подвергается протеолизу; в) после

разрушения клеток целевой белок отделяется от остального клеточного со-

держимого простым центрифугированием. Из телец-включений рекомби-

нантные белки переводят в раствор с помощью высоких концентраций хао-

тропных агентов – мочевины или гуанидин-хлорида и при необходимости

дополнительно очищают. Однако следует иметь в виду, что при выделении

белка из телец-включений часто возникают проблемы его посттрансляцион-

ного фолдинга (т. е. формирования правильной, функционально активной

третичной структуры). Дело в том, что молекулы белка в тельцах-

включениях не обладают определенной третичной структурой и специфиче-

ской активностью. Особенно остро эта проблема может возникнуть, напри-

мер, когда целевой белок должен образовывать правильные S-S мосты.

При экспрессии рекомбинантного белка в цитоплазму современная

биотехнология предлагает системы, позволяющие проводить и выделение, и

очистку белка в одну стадию. Для этого конструируют плазмиды, в которых

рядом с геном целевого белка находится последовательность, кодирующая

дополнительный признак. Получаемые при этом химерные белки за счет

этого признака обладают аффинностью к определенным белкам или гапте-

нам, иммобилизованным на твердом инертном носителе. Грубый необога-

щенный клеточный экстракт пропускают через такой носитель, и из всей

смеси на нем сорбируется только целевой рекомбинантный белок. После

промывок его элюируют в специальных условиях в практически индивиду-

альном состоянии.

Ярким примером такой системы является так называемая металл-

хелатная хроматография. В ее основе лежит способность ионов двухвалент-

ных переходных металлов (Ni

, Co

, Zn

и др.) образовывать комплексные

соединения, в частности с молекулами имидазола. Белки, обогащенные гис-

тидиновыми остатками, обладают повышенным сродством (аффинностью) к

сорбентам, на поверхности которых иммобилизованы ионы этих металлов

МОДУЛЬ 3. ИНЖЕНЕРНАЯ ЭНЗИМОЛОГИЯ

Работа 3.1. Выделение ферментов (на примере светящихся белков)



Введение в биотехнологию. Метод. указания по лабораторным работам

-49-

(металл-активированная матрица). Это обогащение можно произвести искус-

ственно, закодировав полигистидиновые фрагменты на С- или N-концах мо-

лекулы целевого белка. (Какие кодоны кодируют гистидин?). При контакте с

металл-активированной матрицей из всех белков клеточного лизата на ней

абсорбируются только рекомбинантный белок с искусственным поли-His

фрагментом. Для элюции этого белка используют либо растворы имидазола,

либо растворы с пониженным значением рН (4–5). Если необходимо изба-

виться от поли-His фрагмента, в генетическую конструкцию между геном

белка и геном этого фрагмента «вшивают» участки, кодирующие специфиче-

ские протеазные сайты. После инкубации раствора целевого белка с соответ-

ствующей протеазой отщепленный фрагмент отделяют повторным пропуска-

нием полученной смеси через металл-активированную матрицу.

Широко известны и используются в нашей лаборатории для выделе-

ния рекомбинантных светящихся белков подобные системы фирм Clontech

и Qiagen.

В рамках данной работы предлагается провести выделение двух реком-

бинантных белков – апообелина и зеленого флуоресцентного белка (GFP).

1. Биомасса двух видов трансформированных клеток E. coli;

2. Буферные растворы для промывки телец-включений:

а) 20 мМ раствор Трис-HCl, рН 7,0 – 100 мл;

б) 0,9 % раствор NaCl в а) –20 мл;

в) 0,1 % раствор Triton X-100 в а) –20 мл;

г) 5 мМ раствор CaCl

в а) –20 мл;

д) 6М мочевина, 20 мМ Трис-HCl, рН 7,0, 5 мМ CaCl

– 20 мл;

(Все перечисленные растворы студенты готовят из соответствую-

щих концентрированных растворов.)

3. Ультразвуковой дезинтегратор;

4. Центрифуга и пробирки к ней;

5. Весы для уравновешивания центрифужных стаканов;

6. Набор автоматических пипеток и наконечники к ним.

1. Ресуспендировать клетки в пятикратном объеме 20 мМ раствора

Трис-HCl, рН 7,0 (вес/объем) и разрушить с помощью УЗ-дезинтегратора

(5х20 сек при охлаждении льдом).

2. Полученную смесь центрифугировать (4-5 тыс. об./мин, 20 мин).

Опишите, как выглядят полученные вами супернатанты и осадки.

3. Супернатант отделить, а осадок ресуспендировать в таком же объеме

раствора б) и вновь отцентрифугировать.

МОДУЛЬ 3. ИНЖЕНЕРНАЯ ЭНЗИМОЛОГИЯ

Работа 3.1. Выделение ферментов (на примере светящихся белков)



Введение в биотехнологию. Метод. указания по лабораторным работам

-50-

4. Повторить процедуру 3, используя для промывки осадка последова-

тельно растворы в) и г).

5. Полученный осадок ресуспендировать в том же объеме раствора д) и

оставить при перемешивании на ночь при 4

С.

1. Проанализируйте выделение природного и рекомбинантного обели-

нов на основании предложенных результатов (таблицы по результатам выде-

ления и данные гель-электрофореза прилагаются отдельно).

2. Какие методы используют для разрушения бактериальных клеток?

3. Что такое “тельца-включения”? Какие преимущества и недостатки

они имеют при выделении рекомбинантных белков?

4. Для чего промывают тельца-включения каждым из растворов а)-г)?

5. Как переводят белки из телец-включений в раствор?

6. Сравните составы полученных фракций по данным (прилагаются от-

дельно) гель электрофореза. Почему апообелин выделяется из осадка телец-

включений, а GFP из супернатанта?

7. Как предлагается проводить одностадийное выделение и очистку

рекомбинантных белков металл-хелатной хроматографией по данным руко-

водств фирм Clontech и Qiagen?

ы: знакомство с методами детекции ферментативной актив-

ности; спектрофотометрическое определение активности щелочной фосфата-

зы; определение биолюминесцентной активности Са

2+ –

активируемого фото-

протеина обелина.

Для того чтобы успешно проводить работы с ферментами и, в частно-

сти, их выделение и очистку, необходимо уметь эффективно (быстро, просто

и наглядно) определять их специфическую активность или скорость фермен-

тативной реакции. Её определяют как количество превращенного субстрата

или количество образовавшегося продукта в единицу времени. Скорость ре-

акции следует определять в начальный промежуток времени и следить за

поддержанием температуры, значения рН, избытка субстратов и кофакторов

в реакционной смеси. Все эти правила и закономерности изучались студен-

тами в курсе биологической химии. Чтобы убедиться в том, что измеренная

активность ферментного препарата определяется только его концентрацией,

его содержание увеличивают или уменьшают в два раза. Если при этом ак-

тивность также меняется в два раза, это означает, что в данных условиях ак-

тивность фермента определяется только его содержанием.

Методы детекции ферментативной активности связаны с природой ре-

акции, которую данный фермент катализирует. Когда в процессе фермента-

тивной реакции образуются или поглощаются газообразные продукты, для