Елинов Н.П. Основы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

На селективной среде погибают партнеры первой системы;

четвертая пара клеток не растет в

культуре,

поскольку оба партнера

не пролиферирующие. Гибридные клетки третьей пары немного-

численны и слабо растут, они вскоре погибают (к тому же они

отличаются по морфологии вырастающих колоний от второй пары

клеток). Гибридные клетки второй системы быстро растут при

потере хромосом у непролиферирующего партнера (В-лимфоци-

ты).

Поэтому формируются две группы гибридом — секретирую-

щие и несекретирующие Ig. Первые медленно растут и поэтому

возникает проблема — не потерять их в последующих операциях.

Таким образом, особенности гибридизации заключаются в том,

что неслившиеся клетки селезенки лишены способности к длитель-

ному культивированию (они исчезают), тогда как миеломные

клетки, напротив, за счет своих потенций к росту могут вытеснить

гибридные клетки. Чтобы этого не произошло, используют селек-

тивные среды. Так, отбирают миеломного родителя с генетическим

дефектом по ГГФРТ, не использующего экзогенный гипоксантин

м^,сн

—NH-/_V-CC-NH-<^-COOH

соон

аминоптерин (4-аминофолиевая кислота)

для синтеза пуринов. Клетки селезенки не обладают таким гене-

тическим дефектом и поэтому миеломные клетки, не синтезирую-

щие нуклеотиды, через определенноеиремя исчезают из культуры.

Гибридомы остаются единственными делящимися клетками. Тогда

через сутки инкубации 50% объема среды заменяют на среду,

содержащую 10"

М гщтоксантина, 10'

М аминоптерина и 4

•

М тимидина (среда ГАТ). Среду сменяют каждые сутки в течение

двух дней, а затем — один раз через 48 часов. Примерно через 2

недели гибридомы начинают активно расти. Необходимо следить,

чтобы не было слишком густого роста — признак развития поли-

клональной популяции; негустая суспензия клеток обеспечивает

рост моноклональных гибридом (выживаемость клеток при этом

невысокая).

В течение 10—14 дней дефектные клетки элиминируются.

Миеломные клетки, устойчивые к бромдезоксиуридину, дефектны

по тимидинкиназе (ТК"), а устойчивые к 8-азогуанину, не содержат

ГГФРТ (ГГФРТ). Эти клетки не располагают обходными путями

синтеза пуринов или пиримидинов, но способны синтезировать

575

основания для ДНК и РНК, используя путь, блокируемый аминоп-

терином (а, б).

Углеводы + Аминокислоты

Аминопте-

риновый

блок

Нуклеотиды

Основной путь

-ДНК

ГТФРТ, ТК

Основания

Вспомогательный

путь

Нуклеозиды

Исходная

опухолевая

клетка

(ГГФРТМК*)

8=Азогуанин

ГТФРТ

Мутанты

(ГГФРТ",ТК")

ТК

-»Мутантные

опухолевые

клетки

(ГТФРТ", ТК";

(а)

Основной и вспомогательный

пути синтеза нуклеотидов у

гибридных клеток

5=Бромдезокси —

уридин

(б)

Схема получения мутантных

опухолевых клеток

На селективной среде ГАТ клетки ТК

и ГТФРТ" не растут и

погибают; на ней растут природные клетки миеломы, но они

выживают недолго (несколько суток). Лишь гибридные клетки

выживают на среде ГАТ при условии наличия у них генов, коди-

рующих ТК и ГГФРТ

(в

Х-хромосоме). Схема получения гибридомы

показана на странице 577.

При наличии гибридов производят смену среды Дальбекко (без

аминоптерина) в течение последующих

дней и, наконец, добав-

ляют минимальную модифицированную среду Дальбекко. После

этого следует скрининг (от англ. screen — решето, просеивать)

гибридных клеток по образованию антител, используя серологи-

ческие реакции, радиоиммунный, иммунофлуоресцентный или

иммуноферментный анализ. Более чувствительный из них радио-

иммунный метод.

Только часть клеток оказывается продуцентами Ig. Положи-

тельные гибриды сразу же клонируют и реклонируют во избежа-

ние реверсии, или возврата к неактивному состоянию.

Из разных способов клонирования наиболее широкое распро-

странение получил метод предельных разведений, когда стремятся

получить одну гибридомную клетку на ячейку платы с вероятно-

стью в 63%, что следует из распределения Пуассона: i(0) = е*\ где

f (0) — число ячеек без роста,

— среднее число клонов на ячейку,

е' — основание натурального логарифма; при Х-1 значение f(0)

576

равно

0,37,

то есть гибридомные клетки, посеянные с эффективной

концентрацией одна клетка на ячейку, не вырастут в 37 ячейках

из 100. Фактически вероятностный процент роста гибридомных

клеток будет ниже, поскольку не все из них дают растущие клоны.

Вот почему на практике высевают их с разными концентрациями.

Оценку растущего клона в ячейке проводят визуально.

Миеломные клетки Х63—Ад8 Приготовление суспензии

селезеночных клеток

подсчет I подсчет

центрифугирование в растворе Эрла (200 д) 10 минут

10 клеток I

10"

клеток

Объединение клеток, центрифугирование (200 д) 10 минут

•

к 1 мл осадка ГАЕ—гемагглютинирующая

1000 ГАЕ вируса Сендай I единица

ресуспендирование

20 минут

на

льду с периодическим встряхиванием

* - .

30 минут

при

37'С

периодическим встряхиванием

Двухкратное отмывание в среде Дальбекко

Ресуспендирование в 50 мл той же среды

Распределение суспензии

лунки планшет (по 1

мл в 48

лунок)

На

•

дующий день добавление среды Дальбекко, садержащей ГАТ

Смена питательной среды в течение 14 дней (каждый второй или третий

день),

удаление 0,5 объема + 0,5 объема свежей среды

Да < гибриды •

т.

8524

577

В последние годы отбор гибридом для клонирования проводят

с использованием автоматизированного оборудования. На после-

дующем этапе получают массовую культуру гибридомных клеток:

1) в культуре ткани — предпочтительный способ, так как Ig

выделяют с большей чистотой;

2) в ферментаторах — суспензионная культура;

3) в организме сингенных животных (мыши, крысы). Накоп-

ленные МкАТ (10—200 мгк/мл среды) выделяют с помощью выса-

ливания аммония сульфатом до

95%

чистоты, а, при необходимости,

подвергают очистке (рис. 163).

Рис.

163.

Схема получе-

ния моноклинальных анти-

тел с помощью гибридом-

ной техники: АС — агент

слияния клеток,

—В-кдет-

ки из селезенки иммунной

мыши, 2 — культура мие-

ломных клеток мыши, 3 —

' гибридизация, 4 — гибри-

домы, 5 — селекция и кло-

нирование гибридом, 6 —

гибридомы, образующие

моноклональные антитела,

—-

введение гибридом, об-

разующих моноклональ-

ные антитела, в организм

сингенной мыши, 8

—

клет-

ки гибридомы, образую-

щие моноклональные анти-

тела, культивируемые в ви-

де культуры ткани, 9

—

вы-

ращивание гибридомных

клеток, образующих моно-

клональные антитела, в

ферментаторе, 1дкж — им-

муноглобулины в культу-

ральной жидкости, Igac —

иммуноглобулины в асци-

тической жидкости, 10 —

высаливание Ig-ов аммония

сульфатом,

— стандарти-

зация Ig-ов,

12 —

лиофили-

зация Ig-ов.

578

Перевод гибридных клеток в большие объемы среды при

крупномасштабном культивировании всегда сопряжен с большими

трудностями, так как не каждый их клон выживает в таких

условиях. Поэтому на практике стремятся делать разбавление

"маточных" клеток постепенно, вначале

1:2—1:3,

а затем и более,

используя специальные культиваторы (рис. 164).

Для выращивания гибридом в

суспензионных культурах важны

бессывороточные среды, посколь-

ку это улучшает процесс культи-

вирования в больших емкостях,

снижает примерно в 500 раз бел-

ковые примеси и заметно сказы-

вается на снижении стоимости це-

левого продукта. Фирма Sigma

(США) выпустила в продажу та-

кую среду (в сухом/жидком виде)

под названием НуЬгу-Мах, не со-

держащую сыворотки и белков

(SFPF-Serum Free, Protein Free).

SFPF-среда включает аминокис-

лоты, витамины, нуклеотидные

предшественники, глюкозу, липи-

ды,

прогестерон, неорганические

соли и микроэлементы. Подобная

среда рекомендована для слияния,

клонирования, выращивания гиб-

ридомных и миеломных клеток, а

также для поддержания на соот-

ветствующем уровне продукции

антител. Всего в среде содержится

82 ингредиента (22 аминокисло-

ты,

12 витаминов, 27 неорганиче-

ских веществ й 21 другое соеди-

нение)

11.5.3.

Применение моноклональных антител. Практическое

использование МкАТ исключительно многообразное

—

в медицине

и ветеринарии (в целях диагностики, терапии), в биотехнологии

для получения, выделения и очистки специфических продуктов, в

исследованиях фундаментальных и прикладных проблем. Так,

например, стволовые клетки костного мозга не обладают какими-

579

Рис.

164.

Культиватор гибридомных

клеток (общий вид) фирмы IBF

biotechnics.

либо характерными особенностями, по которым можно было бы

их отличить от других клеток. К тому же в костном мозге на них

приходится где-то порядка 0,05% от всех клеток.

Стволовая клетка и сывороточйый белок а-фетопротеин, от-

крытый Г. И. Абелевым, впервые появляются в желточном мешке

эмбриона. Спустя некоторое время стволовые клетки переселяют-

ся в печень эмбриона и там же интенсивно синтезируется сыво-

роточный а-фетопротеин.

желточном мешке и печени протекает

активное кроветворение. Позже синтез этого белка прекращается,

а стволовая клетка перемещается в костный мозг, где и происходит

кроветворение в течение всей последующей жизни'Ърганизма.

Используя МкАТ против поверхностного CD-белка стволовых

клеток, ученые из США и Германии близко подошли к выделению

таких клеток, массовое получение которых могло бы быть реша-

ющим в терапии лучевой болезни, талассемии, тяжелых осложне-

ний при иммунодефицитах, лейкемии и других заболеваний. На

способности стволовых клеток к переселению основывается спо-

соб лечения лучевой болезни внутривенным введением стериль-

ного костного мозга.

Неоценимый вклад внесен в- оценку CD-рецепторов клеток с

помощью МкАТ. Это позволяет глубже понять механизмы клеточ-

ных взаимодействий в целях направленного вмешательства для их

коррекции при патологических состояниях.

Непреходяще значение МкАТ в диагностике, в том числе —

при использовании иммуноферментного анализа в различных его

вариантах, включая метку коллоидного золота. Например, чтобы

локализовать тироксин-секретирующие клетки в образце ткани

щитовидной железы, эту

ткань инкубируют с мыши-

ным моноклональным анти-

тироксином. Затем на обра-

зец наносят конъюгат "анти-

Ig-золото", специфичный к

Ig-антитироксину. Фиксиру-

ясь на моноклональном ан-

тителе, конъюгат становится

прекрасной меткой, выявля-

емой в световом биологиче-

Рис. 165. Схема взаимодействия конъюгата

ском

микроскопе ПО крас-

;;анти-1д-золото" с моноклональным антителом

й ске ЗОЛ

ОТа (рис.

антитироксин

(2),

заякоренным на срезе ткани г \г

щитовидной железы (1). loo).

580

Очень важно использование МкАТ для прицельной доставки

например цитостатиков в злокачественные клетки на предмет их

деструкции и, как следствие, для лечения соответствующего боль-

ного с опухолевым процессом.

При диагностике, например СПИД, на покрытой моноклиналь-

ными антителами ячейке выявляется концентрация антигенного

белка р24 вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) порядка

1,0—1,56

пикограмма в течение 1,5—3 часов; при цитомегалови-

русной инфекции МкАТ типа Е-13 используют для выявления

позднего антигена спустя 72 часа после заражения; важен вклад

МкАТ в диагностику герпеса, краснухи, токсоплазмоза, различных

бактериальных и грибковых инфекций, и т. д. В настоящее время

около 30 компаний в мире производят МкАТ в виде диагностиче-

ских наборов, а 13 компаний разработали оборудование или тех-

нологические процессы, относящиеся к МкАТ; теперь на рынке

имеются такие антитела против классов и подклассов иммуногло-

булинов человека, отдельных белков человека и животных, гормо-

нов и лекарств, и многие

другие.

Например, в 1991 г. американская

компания "Centocor" выпустила в продажу новое моноклональное

лекарство "Центоксин" для лечения сепсиса, вызванного грамот-

рицательными бактериями.

Ныне издают книги и журналы, посвященные МкАТ, и уже это

одно является веским доводом в пользу огромной роли их в

фундаментальных и прикладных исследованиях самого широкого

профиля.

11.6.

Трансгенные животные. Включение чужеродных после-

довательностей ДНК или трансгенов в геном макроорганизма —

реципиента с последующей устойчивой их наследуемостью в ряду

поколений обеспечивает получение так называемых трансгенных

животных. Следовательно, процесс трансгенеза по своему меха-

низму относится к генетической инженерии и, в частности, к

генной и клеточной инженерии.

Доказано, что трансгены нередко экспрессируются, вызывая

те или иные структуры и функциональные изменения вплоть до

изменения "программы" развития организма. Подобного рода экс-

перименты сулят заметный прогресс в области фундаментальных

и прикладных разработок. К разряду фундаментальных относят:

анализ различных отклонений в экспрессии нормальных и мути-

ровавших

генов,

включая онкогены; осуществление направленного

мутагенеза за счет введения в макроорганизм экспрессирующих

581

специальных "конструкций", предназначенных определенным ге-

нам и т. д.

К разряду прикладных исследований можно отнести, например,

получение быстро растущих трансгенных свиней, выведение

трансгенных овец, образующих и накапливающих в молочных

железах некоторые факторы свертываемости крови человека и др.

Для получения трансгенных животных, в частности — мышей,

можно воспользоваться такими методами, как микроинъекции

ДНК в оплодотворенное одноклеточное яйцо, заражение предим-

плантированных эмбрионов рекомбинантными ретровирусами, и,

наконец, применение эмбриональных стволовых ES- или ЕК-кле-

ток.

Быстрота выполнения и надежность метода микроинъекций

сделали его наиболее популярным среди специалистов-экспери-

ментаторов. Используют различных линейных мышей, обеспечен-

ных всем необходимым при хорошем их содержании в условиях

вивария (животника). Обычно в опыт по микроинъекции берут не

менее 20 гибридных самцов-производителей первого поколения

(FI) в возрасте 8—12 месяцев, когда они характеризуются хорошей

производительностью. При слабой или низкой активности самцов

к подсаживаемым самкам их заменяют. Донорами оплодотворен-

ных яйцеклеток выступают не менее 10 неполовозрелых (12—14

г) гибридных самок первого поколения (FI), подвергшихся супер-

овуляции и спариванию с гибридными самцами FI. Оплодотворен-

ные одноклеточные яйца выделяют из операционно вскрытых

яйцеводов самок-доноров спустя 12 часов после их спаривания с

самцами-производителями. Выделенные яйца помещают в культу-

ру на срок от 3 до 36 часов. От 10 самок можно получить 250 яиц,

пригодных для микрринъекций.

Оплодотворенные яйцеклетки поддерживают на среде М16 в

микрокапельной культуре в С0

-инкубаторе тканей при 37°С и с

5% диоксида углерода. Все другие манипуляции с яйцеклетками

вне инкубатора проводят в HEPES-забуференной среде М2 (HEPES

— это N-2-гидроксиэтилпиперазин — Г\Г-2-этансульфоновая кис-

лота).

Компонентный состав сред (кроме HEPES) почти тождест-

венен. Различие касается натрия бикарбоната, фенолового крас-

ного,

натрия пирувата и кальция хлорида дигидрата, доля которых

в среде М16 больше, чем в среде М2. Остальные ингредиенты

представлены

KCL,

NaCL, KH

, MgSO

4 •

7Н

0, натрия лактатом,

глюкозой, пенициллином, стрептомицином, бычьим сывороточным

альбумином (БСА), внесенными в бидистиллированную воду.

582

Изолированные оперативным вмешательством яйцеклетки из

яйцеводов выдерживают в атмосфере 5% С0

при 37°С до микро-

инъекции в них клонированных ДНК любого размера в количестве

1—2 нл 0,0001—0,0005% раствора ДНК с помощью микроманипу-

лятора.

Для трансплантации оплодотворенных яйцеклеток, в которые

была инъецирована экзогенная ДНК, используют "суррогатных"

матерей — псевдобеременных реципиентных самок (12 часов post

coitum), вынашивающих такие яйцеклетки.

В целях получения псевдобеременных мышей половозрелые

самки F-1 (19—20 г) в стадии эструса (течки, овуляции) спаривают

со стерильными самцами, у которых операционно блокированы

семявыносящие протоки. Наилучшие результаты получают с сам-

цами линии Parkes, обладающих высокой половой активностью.

Обычно используют 20—30 таких самцов, которых спаривают

через день с названными выше самками (получают в среднем 5

псевдобеременных самок в день). Псевдобеременные самки при-

годны для пересадки донорских оплодотворенных яйцеклеток.

Отбирают яйцеклетки, переживших микроинъекцию ДНК, и

вводят их в специальную микропипетку, с помощью которой

привносят в яйцевод псевдобеременной мыши оплодотворенную

яйцеклетку с включенной в нее клонированной ДНК. Часть пере-

саженных яиц погибает, а часть продолжает нормально развивать-

ся.

После этого естественным путем (или с помощью кесарева

сечения) получают трансгенное потомство, идентифицируемое с

помощью гибридизационного анализа высокомолекулярной геном-

ной ДНК, изолированной из хвоста (отрезают кончик хвоста

длиной примерно 1 см).

При гомологии трансгена с каким-либо участком генома мыши

используют блот-гибризацию, если же гомология незначительна

или она отсутствует совсем, то ограничиваются дот-блот- или

слот-блот-анализом (от анг. blot — пятно, blotting — промокание,

dot — точка, slot — прорез, паз). В первом случае, когда трансген

идентичен эндогенному гену, он все равно окружен другими

нуклеотидными последовательностями. Поэтому, используя ре-

стриктазы, удается доказать локализацию трансгена в иных ре-

стрикционных фрагментах. Во втором случае, когда трансген

негомологичен геному мыши, то он ограничен другими сайтами

рестрикции, и здесь удобен дот-блот- или слот-блот-анализ в

качестве экпсресс-метода. Фрагменты анализируемой геномной

ДНК на нитроцеллюлозных фильтрах выявляют при экспозиции с

рентгеновской пленкой.

583

Трансгенные линии животных получают после скрещивания

первичных трансгенных экземпляров.

Изложенные события по получению трансгенных мышей схе-

матично представлены на рис. 72.

Как уже было сказано в начале этого раздела, другим методом

получения трансгенных животных (в частности, мышей) является

заражение предимплантированных эмбрионов рекомбинантными

ретровирусами, которые оказались удобными объектами для этих

целей. Геном ретровирусов сравнительно небольшой и с ним

относительно легко манипулировать, вводя в него чужеродные

гены; ретровирусы достаточно инфекционны в отношении пермис-

сивных клеток (почти 100% заражение их), а единственная копия

ретровирусного генома ДНК прочно и строго определённым обра-

зом интегрируется с ДНК клетки-мишени и эти последние способ-

ны экспрессировать привнесенные вирусом гены. Уровень экс-

прессии клонированных генов заметно повышается вследствие

того,

что в ретровирусах имеются весьма активные транскрипци-

онные энхасеры, или усилители (см.). Известные ретровирусные

векторы ведут свое происхождение от вирусов лейкоза мышей

(MLV) или от вирусов птиц (ALV).

Геном ретровирусов функционирует по схеме:

РНК обРагааятранскриптаза

у днк > рнк > Бел(Ж

Каждая вирусная частица содержит две копии одноцепочечного

РНК-генома, а после проникновения в пермиссивную клетку этот

геном переводится в линейную двухнитевую ДНК под влиянием

вирусного фермента — обратной транскриптазы. Чтобы интегри-

роваться в клеточный геном клетки-мишени, линейная ДНК про-

никает в ядро, где приобретает кольцевидную форму. Интегриро-

ванная линейная ДНК-копия ретровирусного генома (провирус)

имеет на обоих концах длинные нуклеотидные повторы — LTR (от

англ. long termine repeats).

5'LTR

несет промотор, с которого

начинается транскрипция генов интегрированного провируса; 3'

LTR-сайт полиаденилирования, где происходит терминация РНК-

транскриптов (см. рис. 23).

Существует ряд векторов на основе ретровирусного генома. В

простейших случаях удаляют структурные гены и на их место

встраивают один или больше рестрикционных сайтов в целях

584