Калинина О.С., Паникар И.И., Скибицкий В.Г. Ветеринарная вирусология

Подождите немного. Документ загружается.

Лабораторна діагностика вірусних хвороб

ВІДБІР КЛІНІЧНОГО І ПАТОЛОГОАНАТОМІЧНОГО

ВІРУСОВМІСНОГО МАТЕРІАЛУ

У лабораторній діагностиці вірусних хвороб тварин точність діа-

гнозу залежить передусім від правильного відбору патологічного

матеріалу від хворих, загиблих або вимушено забитих тварин і

швидкого транспортування його в лабораторію.

Загальне правило: патологічний матеріал потрібно брати по мож-

ливості стерильно, якнайскоріше після появи чітких клінічних

ознак хвороби, коли концентрація вірусу є максимальною, або не

пізніше 2 – 4 год після загибелі, щоб уникнути дисемінації кишко-

вої мікрофлори (внаслідок послаблення бар’єрної функції кишок) і

посмертних змін тканин. Слід враховувати той факт, що при бага-

тьох вірусних інфекціях (наприклад, хворобі Тешена) спостерігаєть-

ся феномен посмертної аутостерилізації, що робить неможливим

виділення збудника.

Патологічний матеріал беруть з урахуванням тропізму вірусу і

шляхів виділення його з організму в різні стадії хвороби. За тропіз-

мом віруси поділяють на п’ять основних груп: пневмотропні, нейро-

тропні, дерматропні (епітеліотропні), політропні та пантропні.

При респіраторних інфекціях (грип свиней і коней, парагрип-3 ВРХ,

РС-інфекція ВРХ) відбирають носовий слиз, носоглоткові змиви, сли-

зові оболонки верхніх дихальних шляхів, легені, бронхіальні й сере-

достінні лімфатичні вузли. При нейроінфекціях (сказ, хвороба Теше-

на, східний, західний і венесуельський енцефаломієліти коней) на-

правляють головний і спинний мозок. При хворобах, які спричиню-

ються дерматропними вірусами (віспа, ящур, везикулярний стома-

тит), відбирають стінки і вміст везикул, пустул, роблять зіскрібки з

уражених ділянок шкіри і слизових оболонок. При хворобах, що су-

проводжуються ураженням травного каналу (ротавірусний і корона-

вірусний ентерити ВРХ), направляють калові маси, слизову оболонку

тонких кишок, брижові лімфатичні вузли. При інфекціях, спричине-

них політропними вірусами (наприклад, інфекційний ринотрахеїт

ВРХ), відбирають патологічний матеріал залежно від клінічного про-

яву хвороби: змиви з носа, кон’юнктиви і статевих органів, сперма,

абортований плід, слизові оболонки респіраторного і травного кана-

лів, паренхіматозні органи, мигдалини, лімфатичні вузли, головний

мозок. Якщо підозрюється пантропний вірус (наприклад, хвороби Ау-

єскі, чуми свиней), направляють паренхіматозні органи, лімфатичні

вузли, головний і спинний мозок, оскільки пантропні віруси можуть

розмножуватися в різних типах клітин.

У гострій стадії хвороби в період вірусемії обов’язково беруть кров

(з яремної вени в об’ємі 5 – 10 см

) з метою виділення вірусу. Це сто-

сується насамперед захворювань, що спричинюються пантропними

вірусами. Для виділення вірусу використовують цільну дефібрино-

Розділ 11

вану або «лакову» кров (суміш крові з дистильованою водою 1 : 1),

або окремі кров’яні елементи (для цього кров беруть з антикоагу-

лянтом — 2,5%-й розчин натрію цитрату на 0,9%-му NaCl 1 : 2;

0,2 см

рідкого гепарину з активністю 5 тис. ОД/см

або 0,2 см

сухо-

го гепарину на 100 см

крові; консервувальний розчин Альсевера

1 : 5). Крім того, кров потрібна для серологічного дослідження. З

цією метою її беруть без антикоагулянту в об’ємі 10 – 15 см

, двічі в

одних і тих самих тварин, на початку і наприкінці хвороби з інтер-

валом 2 – 3 тижні для отримання парних сироваток крові.

Носовий секрет відбирають за допомогою стерильного ватного

або поролонового тампона, до якого прив’язують шпагат. Тампон

вводять у носовий хід, витримують 20 – 30 хв, потім вміщують у

шприц і поршнем витискують секрет у пробірку. Аналогічно отри-

мують вагінальний і цервікальний секрети.

Для одержання змивів зі слизових оболонок (носа, рота, носо-

глотки, очей, прямої кишки, вагіни, препуція, клоаки у птиці) від-

повідну порожнину зрошують стабілізувальним середовищем і зби-

рають у флакон рідину, що стікає. Стабілізувальне середовище

складається з 0,9%-го розчину NaCl (рН 7,0) або збалансованого со-

льового розчину Хенкса чи Ерла, або середовища для культури клі-

тин (ГЛА, 199, Ігла), антибіотиків (пеніцилін 500 ОД/см

, стрепто-

міцин 500 мкг/см

і ністатин 20 ОД/см

) і білкового стабілізатора

(0,5 % желатину або 0,5 – 1 % альбуміну сироватки крові ВРХ), який

запобігає швидкій інактивації вірусу. Змиви зі слизових оболонок

можна отримати за допомогою стерильного ватного тампона на де-

рев’яній паличці, змоченого в стабілізувальному середовищі, або

брати мазки за допомогою сухого ватного тампона, протираючи ним

відповідну порожнину. Тампони зі змивами і мазками вміщують у

флакон зі стабілізувальним середовищем.

При ураженні ротової порожнини беруть слину, яку збирають у

пробірку, якщо салівація інтенсивна. При помірній салівації корис-

туються стерильним ватним тампоном, який вводять під щоку, ви-

тримують 10 – 15 хв, потім дістають пінцетом і за допомогою шпри-

ца відтискають слину в пробірку. Для посилення салівації тварині

можна ввести підшкірно пілокарпін (із розрахунку 0,02 – 0,05 мг/кг).

Проби калу беруть із прямої кишки за допомогою шпателя або

палички і вміщують у пробірку чи флакон.

Проби сечі беруть за допомогою катетера в стерильний посуд.

Можна одержувати сечу при природному сечовипусканні або ви-

кликаючи його подразненням зовнішніх статевих органів.

Везикулярну і пустульозну рідини відсмоктують шприцом із тон-

кою голкою або пастерівською піпеткою, кінці якої запаюють. Поверх-

Консервувальний розчин Альсевера: 24,6 г глюкози, 9,6 г натрію цитрату, 5,04 г

натрію хлориду і 1200 см

дистильованої води.

Лабораторна діагностика вірусних хвороб

ню везикул і пустул попередньо обробляють спиртом або ефіром. Мож-

на відразу розбавити рідину стабілізувальним середовищем (1 : 5).

Стінки везикул і пустул, кірки й луски з поверхні шкіри зніма-

ють пінцетом і вміщують у флакони зі стабілізувальним середови-

щем. Також роблять зіскрібки з уражених ділянок шкіри і слизових

оболонок ротової порожнини та носового дзеркала. Зіскрібки зі сли-

зової оболонки глотки і стравоходу беруть спеціальним зондом.

Розтин трупів тварин проводять згідно із загальноприйнятою ме-

тодикою. Для вірусологічного дослідження найчастіше беруть легені,

печінку, селезінку, нирки, лімфатичні вузли, слизові оболонки носа,

рота, трахеї, бронхів, тонких кишок, шматочки новоутворень. За

наявності макроскопічних змін органів з ураженої ділянки вирізають

шматочки масою 10 – 20 г, захоплюючи також неушкоджену тканину.

Головний мозок беруть повністю, розпилюючи черепну коробку після

видалення волосяного покриву, шкіри і м’язів та зняття твердої мозко-

вої оболонки. Спинний мозок виймають цілим або фрагментами разом

із корінцями, розсікаючи вздовж хребта м’язи спини, остисті відростки

хребців і видаливши тверду мозкову оболонку.

Консервування і транспортування проб патологічного мате-

ріалу. Взятий патологічний матеріал потрібно якнайшвидше закон-

сервувати, щоб зберегти вірус, оскільки його титр за відсутності жи-

вих клітин швидко знижується. Найкращим методом консервування

патологічного матеріалу є використання термосів з охолоджувальни-

ми сумішами: 1) три частини льоду та одна частина кухонної солі

(–15…–20 ºС); 2) суміш однакових об’ємів сухого льоду (твердої

вуглекислоти) й етилового спирту (–70 ºС); 3) сухий лід (–79 ºС).

Треба мати на увазі, що деякі віруси швидко гинуть при заморо-

жуванні. Це стосується насамперед респіраторних вірусів (напри-

клад, віруси ПГ-3 і РС ВРХ). Тому для збереження таких збудників

патологічний матеріал консервують за температурт танучого льоду

(+2…+4 ºС). У деяких випадках вірусовмісний матеріал зберігають у

рідкому азоті (–196 ºС), зокрема кров і пухлинну тканину при діаг-

ностиці хвороби Марека.

Для консервування шматочків органів і тканин можна використо-

вувати 50%-й розчин гліцерину (на 0,9%-му розчині NaCl) у співвідно-

шенні 1 : 5 … 1 : 10. Однак треба мати на увазі, що такий патологічний

матеріал не придатний для дослідження в РІФ. Тому одночасно з про-

бами матеріалу, вміщеними у флакони з гліцерином, потрібно напра-

вляти мазки-відбитки на предметних стеклах для люмінесцентної мі-

кроскопії. Гліцерин не підходить для вірусовмісних рідин, особливо

тоді, коли потрібно заражати живі об’єкти (лабораторні тварини, куря-

чі ембріони чи культури клітин). Окрім гліцерину, шматочки органів і

тканин можна вміщувати в стабілізувальне середовище.

Розділ 11

На пробірки і флакони наклеюють етикетки з лейкопластиру, де

пишуть простим олівцем, який саме матеріал і від якої тварини

одержаний. Проби вміщують у металевий контейнер, який кладуть

у термос і обкладають мішечками з охолоджувальною сумішшю.

Проби, консервовані гліцерином або стабілізувальним середовищем,

надсилають незамороженими за температури танучого льоду

(+2…+4 ºС). На термос із пробами патологічного матеріалу прикріп-

люють бирку з картону або фанери, на якій вказують господарство,

вид тварини, вид матеріалу і дату. Термос має бути опечатаним. На

матеріал, що надсилають до лабораторії, пишуть супровідну, де по-

дають повну інформацію про тварину, від якої взято проби, епізо-

отологічні дані господарства, вид матеріалу, попередній діагноз,

прізвище спеціаліста і дату. Цими даними керуються при виборі

напряму лабораторного дослідження.

Доставлені в лабораторію проби треба негайно використати для

виділення вірусу. Якщо з якихось причин (наприклад, відсутність

культури клітин) дослідження відкладається, патологічний матері-

ал потрібно зберігати при –20…–70 ºС. Слід уникати багаторазового

заморожування і відтавання його, оскільки це призводить до інак-

тивації вірусу.

Підготовка вірусовмісного матеріалу для дослідження. У

лабораторії одержаний патологічний матеріал звільняють від кон-

серванту (розморожують, відмивають від гліцерину). Частину мате-

ріалу використовують для вірусологічного дослідження, іншу —

зберігають у холодильнику на випадок додаткових досліджень.

Підготовка органів і тканин (одержання 10%-ї вірусовміс-

ної суспензії). Тканину ретельно подрібнюють ножицями, розти-

рають у ступці з додаванням стерильного кварцового піску, розбав-

ляють фосфатно-буферним розчином (ФБР) або розчином Хенкса з

розрахунку 1 : 10, центрифугують при 2 – 3 тис. об/хв упродовж 15 –

30 хв. Надосадову рідину (вірусовмісну суспензію) переносять у

флакони і додають антибіотики широкого спектра дії для деконта-

мінації (звільнення від супутньої мікрофлори): пеніцилін 100 –

1000 ОД/см

і стрептоміцин 100 – 1000 мкг/см

(дози залежать від

виду тканини). Після експозиції 30 – 60 хв за кімнатної температу-

ри ставлять бактеріологічний контроль: роблять посіви на МПА,

МПБ, МППБ і середовище Сабуро. При негативному результаті бак-

теріологічного контролю вірусовмісну суспензію використовують

для зараження лабораторних об’єктів, а в разі позитивного резуль-

тату її повторно обробляють антибіотиками і знову перевіряють на

стерильність. У рідкісних випадках вірусовмісну суспензію звіль-

няють від мікрофлори пропусканням крізь фільтри (фарфорові, аз-

бестові, мембранні), що пов’язано з частковою адсорбцією на них

вірусу. Вірусовмісну суспензію зберігають при –20…–70 ºС.

Лабораторна діагностика вірусних хвороб

Підготовка секретів і змивів. Секрети і змиви центрифугують

при 2 – 3 тис. об/хв, надосадову рідину обробляють пеніциліном

500 – 1000 ОД/см

та стрептоміцином 500 – 1000 мкг/см

і після бак-

теріологічного контролю використовують для зараження лаборато-

рних об’єктів. З осаду роблять мазки для РІФ. Аналогічно готують

змиви і мазки, отримані за допомогою ватних тампонів, занурених у

стабілізувальне середовище. Тампони струшують 10 – 15 хв, рете-

льно витискають, отриману рідину центрифугують, обробляють ан-

тибіотиками, ставлять бактеріологічний контроль.

Підготовка калу. У флакон зі скляними намистинами вносять

10 см

ФБР або розчину Хенкса і 1 г калових мас. Струшують до

утворення гомогенної суміші, центрифугують при 2 – 3 тис. об/хв.

Надосадову рідину обробляють пеніциліном 500 – 1000 ОД/см

стрептоміцином 500 – 1000 мкг/см

і ністатином 30 – 40 ОД/см

, став-

лять бактеріологічний контроль. Вірусовмісну суспензію зберігають

при –10…–20 ºС. У день зараження лабораторних об’єктів її розмо-

рожують і повторно центрифугують.

Підготовка сечі. Сечу за потреби освітлюють центрифугуванням

при 2 – 3 тис. об/хв, обробляють пеніциліном 500 – 1000 ОД/см

стрептоміцином 500 – 1000 мкг/см

, ставлять бактеріологічний кон-

троль.

Підготовка вмісту везикул і пустул. Нативні везикулярну і пу-

стульозну рідини розбавляють 0,9%-м розчином NaCl або розчином

Хенкса 1 : 5, центрифугують при 2 – 3 тис. об/хв 20 хв, обробляють

пеніциліном 200 – 500 ОД/см

і стрептоміцином 200 – 500 мкг/см

ставлять бактеріологічний контроль. Аналогічно готують везикуляр-

ну і пустульозну рідини, розбавлені стабілізувальним середовищем

1 : 5; освітлюють центрифугуванням, обробляють антибіотиками,

ставлять бактеріологічний контроль.

Підготовка уражень шкіри і слизових оболонок. Стінки везикул

і пустул, кірки та луски шкіри розтирають у ступці зі стерильним

кварцовим піском, розбавляють 0,9%-м розчином NaCl або розчином

Хенкса 1 : 5 – 1 : 10, центрифугують при 2 – 3 тис. об/хв, обробляють

пеніциліном 200 – 500 ОД/см

і стрептоміцином 200 – 500 мкг/см

ставлять бактеріологічний контроль.

Підготовка крові. Кров (дефібриновану, «лакову» або з антикоа-

гулянтом) заморожують. Після відтавання гемолізовану кров

центрифугують при 2 – 3 тис. об/хв 15 хв, обробляють пеніциліном

100 – 200 ОД/см

і стрептоміцином 100 – 200 мкг/см

, ставлять бак-

теріологічний контроль. Для виділення вірусу придатна також зсі-

ла кров. Її розтирають у ступці, додають розчин Хенкса 1 : 1 або

1 : 2, центрифугують, обробляють антибіотиками, ставлять бактері-

ологічний контроль.

Одержання сироватки крові. Беруть 10 – 15 см

крові в стериль-

ну пробірку з гумовою пробкою, витримують 1 год при +37 ºС. Утво-

Розділ 11

рений згусток обводять скляною паличкою або пастерівською піпет-

кою та ставлять на 18 – 20 год у холодильник при +4 ºС (для при-

скорення ретракції кров’яного згустку і збільшення виходу сироват-

ки). Сироватку відбирають піпеткою, за потреби центрифугують при

1500 об/хв для видалення домішок еритроцитів, обробляють пеніци-

ліном 100 – 200 ОД/см

і стрептоміцином 100 – 200 мкг/см

, ставлять

бактеріологічний контроль. Зберігають сироватки в холодильнику

при +4 ºС або в замороженому стані при –10…–20 ºС.

ЕКСПРЕС-ДІАГНОСТИКА ВІРУСНИХ ХВОРОБ

ВІРУСОСКОПІЯ

Вірусоскопію використовують для індикації в патологічному ма-

теріалі віріонів вірусів віспи ссавців і птиці та контагіозної ектими

овець і кіз із родини Poxviridae, розміри яких досягають (170…260) ×

× (300…390) нм. Мазки готують із папул, везикул, пустул або кірок,

у птиці — з віспяних бородавок, висушують на повітрі й перед фар-

буванням вміщують на 3 хв у дистильовану воду. Для фарбування

віріонів найчастіше використовують три методи: Морозова, Пашена

або Герцберга. Найзручнішим і загальнодоступним є метод Морозова.

Фарбування за Морозовим.

1. Реактив № 1 — рідина Руге (1 см

льодової оцтової кислоти,

2 см

формаліну і 100 см

води) — 1 хв; промивають дистильованою

водою.

2. Реактив № 2 — розчин таніну (5 г таніну, 100 см

дистильова-

ної води і 1 см

рідкої карболової кислоти) — 1 – 2 хв; промивають

дистильованою водою.

3. Реактив № 3 — розчин аміачного срібла (5 г срібла нітрату

розчиняють у 100 см

дистильованої води і додають по краплях

25%-й розчин аміаку, поки не розчиниться утворений буро-чорний

осад і не залишиться легка опалесценція; для фарбування реактив

розбаляють дистильованою водою 1 : 10) — 1 – 2 хв при легкому пі-

дігріванні до появи темно-коричневого забарвлення; промивають

дистильованою водою.

Висушені на повітрі або філь-

трувальним папером препарати

розглядають у світловому мікро-

скопі під імерсійною олією. Наяв-

ність на жовтому фоні препарату

великої кількості дрібних темно-

коричневих тілець округлої фор-

ми, які розміщені у вигляді скуп-

чень, рядами або дифузно, свід-

чить про присутність у дослідно-

Рис. 63. Віріони вірусу віспи корів,

фарбування за М.А. Морозовим

(Ш.С. Ніколау та ін., 1965)

Лабораторна діагностика вірусних хвороб

му матеріалі віріонів вірусів віспи або контагіозної ектими овець і кіз

(рис. 63).

Фарбування за Пашеном.

1. Синька Льоффлера (30 см

насиченого спиртового розчину ме-

тиленової синьки і 100 см

0,01%-го розчину калію гідроксиду; ви-

тримують 1 міс у термостаті при +37 ºС для дозрівання) — 1 – 3 хв

при підігріванні до появи пари; промивають дистильованою водою.

2. Фуксин Ціля (1 г фуксину, 10 см

абсолютного спирту і 100 см

5%-ї карболової кислоти) — 1 – 3 хв при підігріванні до появи пари;

промивають дистильованою водою.

3. Абсолютний спирт або 5%-й розчин таніну — 3 – 5 хв; проми-

вають дистильованою водою.

Віріони поксвірусів зафарбовуються в червоно-рожевий колір,

фон препарату — синій.

Фарбування за Герцбергом.

3%-й розчин Victoria blau 4R (фарбу прогрівають у водяній бані

30 хв при +60 ºС, витримують 2 тижні для дозрівання) — 15 хв;

промивають дистильованою водою.

Віріони поксвірусів зафарбовуються в яскраво-синій колір, фон

препарату — блакитний.

Перевагою вірусоскопії є швидкість одержання результатів

(упродовж 0,5 – 1 год після доставляння матеріалу в лабораторію),

простота і доступність техніки виконання. Недоліком є те, що найчіт-

кіші результати можна отримати тільки при дослідженні мазків зі

свіжих везикул і везикулярної рідини (до нагноєння) або свіжих ві-

спяних бородавок у птиці. У разі використання мазків із пустул і

кірок достовірність методу значно знижується. Методом вірусоскопії

не завжди вдається відрізнити віріони від подібних за формою клі-

тинних елементів. Окрім того, вірусоскопія не дає змоги диферен-

ціювати різні види вірусів віспи.

ЕЛЕКТРОННА ТА ІМУНОЕЛЕКТРОННА МІКРОСКОПІЯ

Електронна мікроскопія є важливим методом ідентифікації віру-

сів, який дає змогу диференціювати їх за морфологією. Особливе

значення цього методу при дослідженні вірусів, які важко культи-

вуються в лабораторних умовах, а також при виділенні нових збуд-

ників. Широке застосування електронної мікроскопії в діагностиці

вірусних інфекцій стримується обмеженою доступністю електронних

мікроскопів для лабораторій та їхнім технічним обслуговуванням.

Принцип роботи електронного мікроскопа. Використову-

ють електронні просвічувальні мікроскопи «ПЕМ-100» вітчизняного

виробництва, «JEM 100СХ-2» японської фірми «Jeol», голландської

фірми «Philips» та ін.

Розділ 11

Електронний мікроскоп складається з вертикальної колони, в

якій розміщена електронна гармата й система електромагнітних

лінз, та пульта керування. Всередині колони створюється вакуум

1,3

• 10

… 1,3 • 10

кПа (10

–4

– 10

–5

мм рт. ст.). Джерелом електро-

нів є вольфрамова нитка — катод, при нагріванні якої струмом у

кілька сотень мікроампер відбувається термоелектронна емісія.

Електрони прискорюються в електричному полі з різницею напруги

в кілька десятків тисяч вольт між катодом і анодом. Потік електро-

нів фокусується першою електромагнітною конденсорною лінзою в

пучок, який проходить крізь дослідний об’єкт. Пучок електронів не-

мовби просвічує об’єкт, взаємодіючи з атомами його речовин. При

цьому електрони відхиляються від початкових траєкторій через різ-

ну електронну щільність частин об’єкта. Чим щільніші ділянки

об’єкта, тим більша їхня розсіювальна здатність, отже тим темні-

шим буде їхнє зображення на екрані. Такий змінений потік елект-

ронів фокусується і збільшується другою електромагнітною лінзою

об’єктива, в результаті чого формується первинне проміжне зобра-

ження об’єкта. Це зображення ще раз збільшується третьою елек-

тромагнітною проекційною лінзою й потрапляє на флуоресціюю-

чий екран, де виникає остаточне зображення об’єкта, яке можна фо-

тографувати. Зазвичай розгляд і фотографування об’єкта відбува-

ється за збільшення в 30 – 100 тис. разів. Надалі при фотодруку-

ванні зображення ще раз збільшується в 5 – 10 разів.

Ідентифікацію вірусів проводять визначенням їхньої форми, розмі-

рів і структури. Розміри віріонів та їхніх структурних частин визнача-

ють у нанометрах (нм), ділячи величину, встановлену на електроно-

грамі, на загальне збільшення мікроскопа і фотодруку. Морфологія

віріонів специфічна для кожної таксономічної групи вірусів.

Приготування препаратів для електронної мікроскопії.

Дослідні об’єкти для електронного мікроскопа мають бути у вигляді

вірусовмісних суспензій або ультратонких зрізів, які вміщують на

мідні предметні сітки, вкриті колодієвими, формваровими або ву-

глецевими плівками-підкладками.

Для одержання чіткого зображення потрібно створити різну еле-

ктронну щільність між фоном і об’єктом, а також структурами

об’єкта. Як контрастувальні речовини використовують 2 – 4%-ві

водні розчини фосфорно-вольфрамової кислоти, молібдату амонію,

силіційвольфрамовокислого натрію; 0,5 – 2%-й водний розчин оцто-

вокислого уранілу (ураніл-ацетату); 0,5%-й водний розчин щавеле-

вокислого уранілу (ураніл-оксалату); 1%-й водний розчин мураши-

нокислого уранілу (ураніл-форміату). Контрастувальна речовина

непроникна для електронного пучка, який легко проходить крізь

органічний матеріал. Вона обволікує віріони, проникає в їхні гідро-

фільні ділянки, заміщуючи воду, і робить віріони електронно-

щільними, чітко визначаючи при цьому їхню структуру.

Лабораторна діагностика вірусних хвороб

Для створення контрасту між дослідним об’єктом і фоном препа-

рату застосовують методи негативного і позитивного контрастуван-

ня. При негативному контрастуванні контрастувальна речовина

високої електронної щільності

оточує віріони, що мають меншу

щільність, і вони виглядають

світлішими на темному фоні

(рис. 64). При позитивному ко-

нтрастуванні, навпаки, віріо-

ни виглядають темнішими на

світлому фоні (рис. 65).

Підготовка вірусовмісного

матеріалу для електронної мі-

кроскопії залежить від концен-

трації вірусу, його чистоти від

сторонніх баластних речовин і

морфології. Електронна мікро-

скопія дає позитивні результа-

ти, якщо вміст віріонів у 1 см

вірусовмісної суспензії становить не менше ніж 10

– 10

. Здебіль-

шого потрібне попереднє очищення і концентрація вірусу.

Шматочки органів, тканин і калові маси гомогенізують у 9

об’ємах дистильованої води, освітлюють центрифугуванням при 5 –

10 тис. об/хв 10 – 20 хв, із надосадової рідини готують препарати.

Для очищення і концентрації вірусу до надосадової рідини додають

60 % насиченого розчину амонію сульфату, ретельно струшують і

вміщують на 1 год у рефрижератор. Потім суміш центрифугують

при 9 – 11 тис. об/хв 10 хв, надосадову рідину зливають, а осад ре-

суспендують у 2 – 4 краплях дистильованої води. З такої суспензії

одержують, як правило, препарати високої якості. Змиви зі слизо-

вих оболонок гомогенізують і концентрують ультрацентрифугуван-

ням або ультрафільтрацією. У нативному вигляді, без попереднього

очищення і концентрації можна досліджувати везикулярну і пусту-

Рис. 64. Віріони вірусу АЧК,

негативне контрастування

(В.М. Сюрін та ін., 1998)

Рис. 65. Віріони вірусу фіброми кролів, позитивне контрастування

(А.Ф. Биковський та ін., 1983)

Розділ 11

льозну рідини, суспензію розтертих кірок, носовий секрет, а також

культуральну рідину інфікованої культури клітин та алантоїсну

рідину заражених курячих ембріонів після ізоляції вірусу з дослід-

ного патологічного матеріалу.

Розроблено різні методики виготовлення препаратів із вірусовміс-

них суспензій для електронної мікроскопії. Одним із найпоширені-

ших є флотаційний метод. При цьому на воскову пластинку нано-

сять краплю вірусовмісної суспензії, на яку вміщують на 1 – 2 хв

предметну сітку плівкою-підкладкою вниз для адсорбції вірусу.

Надлишок рідини на сітці видаляють фільтрувальним папером.

Якщо вірусовмісна суспензія недостатньо очищена від баластних

речовин, предметну сітку з адсорбованим вірусом відмивають, вмі-

щуючи її плівкою-підкладкою вниз на 1 – 2 краплі дистильованої

води; надлишок вологи знімають фільтрувальним папером. Далі

проводять контрастування препарату, вміщуючи сітку на 30 – 50 с

на краплю контрастувальної речовини, надлишок якої знімають

фільтрувальним папером.

В електронній мікроскопії широко застосовують дослідження

ультратонких зрізів при вивченні структури віріонів і різноманіт-

них аспектів взаємодії вірусів із чутливими клітинами in vitro та in

vivo. Дослідний об’єкт (шматочки органів і тканин, осад десквамо-

ваних клітин змивів, сечі, калу, клітини зараженої культури) потріб-

но зафіксувати з метою максимального збереження клітинної струк-

тури. Для цього найчастіше застосовують 2,5%-й розчин глутараль-

дегіду або 1%-й розчин чотириокису осмію. Потім об’єкт відмивають

від фіксатора ФБР, зневоднюють у зростаючих концентраціях аце-

тону або спирту, заливають в епоксидну чи поліефірну смолу і полі-

меризують при +95 ºС 60 хв або при +40…+80 ºС 1 – 2 доби. З отрима-

них блоків готують на ультрамікротомах зрізи завтовшки 150 –

300 А°, які монтують на предметні сітки і контрастують.

Імуноелектронна мікроскопія (ІЕМ) ґрунтується на вияв-

ленні в електронному мікроскопі комплексів віріонів з антитілами.

При взаємодії вірусу з антитілами утворюються агрегати віріонів,

оточених ореолом з антитіл, які легше виявити в електронному мік-

роскопі, ніж поодинокі вірусні часточки. Метод IЕМ чутливіший від

електронної мікроскопії в 10 – 100 разів. Він дає змогу виявляти

віріони при титрі вірусу близько 10

3,5

ЕД

/см

, а різні способи при-

готування препаратів можуть підвищити чутливість методу ще на

один-два порядки.

В ІЕМ зазвичай використовують нативну сироватку, освітлену

низькошвидкісним центрифугуванням або фільтруванням. Для

підвищення чутливості методу сироватку освітлюють ультрацент-

рифугуванням або використовують її глобулінові фракції. При до-

слідженні складно організованих вірусів сироватку прогрівають при

+56 ºС 30 хв для інактивації комплементу, який може спричинити