Калинина О.С., Паникар И.И., Скибицкий В.Г. Ветеринарная вирусология

Подождите немного. Документ загружается.

Лабораторна діагностика вірусних хвороб

Інтраназальне зараження. Проводять під легким ефірним нарко-

зом (за винятком кролів), щоб уникнути розбризкування вірусовміс-

ної суспензії при чханні. Сонну тварину фіксують ніздрями догори і в

кожну з них вводять інфекційний матеріал за допомогою шприца або

пастерівської піпетки. Максимальна доза для зараження: миші —

0,05 см

, щури — 0,1, морські свинки — 0,3, кролі — 1 см

Інтрацеребральне зараження. У молодих кролів і морських сви-

нок після видалення шерсті й дезінфекції проколюють шкіру і че-

реп у надочному жолобі, де кістка досить тонка. Для цього викорис-

товують туберкулінову голку з обмежувачем, що забезпечує її про-

никнення не більше ніж на 4 – 5 мм. Кролів старшого віку заража-

ють через трепанаційний отвір, який роблять на 2 см вище попере-

кової лінії, умовно проведеної між зіницями. У мишей і щурів гол-

кою з обмежувачем проколюють шкіру і череп на глибину 1 – 2 мм у

точці, що лежить у центрі квадрата, утвореного середньою сагіталь-

ною лінією й перпендикуляром до неї по зовнішньому краю очниць.

Максимальна доза для зараження: миші — 0,03 см

, щури — 0,05,

морські свинки — 0,1, кролі — 0,3 см

Індикація вірусів у організмі лабораторних тварин. Зара-

жених тварин розміщують в ізоляторах і ведуть щоденне спостере-

ження. Ознаками розмноження вірусів у організмі лабораторних

тварин є клінічні симптоми, патологоанатомічні зміни і загибель

(табл. 3). Треба мати на увазі, що загибель тварин у перші дні після

зараження може бути зумовлена травмою або токсичними фактора-

ми. Клінічні ознаки в заражених лабораторних тварин найчастіше

мають неспецифічний характер (наприклад, пригнічення, зниження

апетиту, задуха та ін.). Однак в окремих випадках біопробою на ла-

бораторних тваринах можна відтворити типову клінічну картину за-

хворювання, зокрема хвороби Ауєскі на кролях і ящуру на морських

свинках. Якщо тварини не реагують на зараження, їх убивають через

проміжок часу, що дорівнює двом інкубаційним періодам, беруть при

розтині відповідний матеріал і проводять наступний пасаж.

Розтин заражених лабораторних тварин роблять відразу після

загибелі з метою аналізу патологоанатомічних змін і відбору вірусо-

вмісного матеріалу. Трупи дрібних тварин фіксують голками на

дошці або кюветі з парафіном у спинному положенні. Для великих

тварин використовують спеціальні столики або дошки з відповідни-

ми фіксувальними пристосуваннями.

Розтин проводять із дотриманням правил асептики й антисепти-

ки. Основне правило розтину: до трупа можна торкатися тільки ін-

струментами або руками в гумових рукавицях. Перед розтином

шкіру обробляють спиртом або дезрозчином (3 – 5%-й фенол). Для

препарування шкіри і підшкірної клітковини роблять розріз по се-

редній лінії від симфізу до шиї, а далі — в напрямку до кінцівок;

шкіру препарують і фіксують голками (рис. 66).

Розділ 11

Таблиця 3. Культивування вірусів на лабораторних тваринах

Вірус

Метод

зараження

Ознаки розмноження вірусу

Білі миші

Вірус сказу і/ц, п/ш Скуйовдження шерсті, горбатість

спини, порушення координації рухів,

параліч кінцівок, загибель

Вірус хвороби Ауєскі і/ц, п/ш Паралічі, загибель

Вірус ящуру п/ш, в/ч Парези, паралічі, загибель, некроз

скелетних м’язів і міокарда

Вірус везикулярного

стоматиту

і/ц, в/ч Скуйовдження шерсті, тремтіння,

атаксія, параліч кінцівок, загибель

Вірус виразкового ма-

міліту ВРХ

і/ц Загибель

Вірус нодулярного

дерматиту ВРХ

і/ц Загибель

Вірус віспи корів п/ш, в/ч Загибель

Вірус вісповакцини в/ш Набряк і вузлики на шкірі

Вірус папіломи ВРХ п/ш Пухлини

Вірус ефемерної гаря-

чки ВРХ

і/ц Збудження, пригнічення, атаксія,

параліч задніх кінцівок, відставання

в рості, загибель

Вірус хвороби Акабане і/ц Втрата рефлексу ссання, паралічі,

загибель

Вірус хвороби Найробі і/ц, в/ч Симптоми енцефаліту, загибель, нек-

роз і геморагії в головному мозку

Вірус лихоманки до-

лини Ріфт

в/ч, в/в, п/ш, в/м,

і/ц

Загибель, некроз печінки, РГА

Вірус інфекційної ка-

таральної гарячки

овець

і/ц Збудження, атаксія, коматозний стан,

загибель

Вірус шотландського

енцефаломієліту овець

і/ц Скуйовдження шерсті, в’ялість, збу-

дження, тремор, порушення коорди-

нації рухів, судоми, парези кінцівок,

загибель

Вірус везикулярної

хвороби свиней

і/ц Тремор, порушення координації ру-

хів, паралічі, загибель

Вірус Сендай і/н Геморагічна пневмонія, загибель

Вірус енцефаломіо-

кардиту

і/ц, і/н, в/ч Скуйовдження шерсті, порушення

координації рухів, судоми, паралічі

задніх кінцівок, загибель

Вірус японського ен-

цефаліту

і/ц Симптоми енцефаліту, загибель

Вірус грипу свиней і/н Симптоми ураження дихальних шля-

хів, загибель, осередкова пневмонія

Вірус грипу коней і/н Симптоми ураження дихальних шля-

хів, загибель, осередкова пневмонія

і/ц Симптоми енцефаломієліту, загибель Вірус ринопневмонії

коней

в/о, і/н Загибель, гепатит

Вірус африканської

чуми коней

і/ц

Парези, паралічі, загибель

Лабораторна діагностика вірусних хвороб

Продовження табл. 3

Вірус

Метод

зараження

Ознаки розмноження вірусу

Вірус західного енце-

фаломієліту коней

і/ц, в/м, в/ч, п/ш Симптоми енцефаломієліту, загибель

Вірус східного енцефа-

ломієліту коней

і/ц, Симптоми енцефаліту, загибель

Вірус венесуельського

енцефаломієліту коней

і/ц, в/м, в/ч, п/ш,

і/н

Симптоми енцефаліту, загибель

і/н Симптоми ураження дихальних шля-

хів, загибель, осередкова пневмонія

Вірус грипу птиці

(класичної чуми птиці)

і/ц, в/в Симптоми токсикозу , загибель

Вірус грипу качок і/н Симптоми ураження дихальних шля-

хів, загибель, осередкова пневмонія

Вірус інфекційного

бурситу птиці

і/ц, в/ч Свербіння, атаксія, тремор, коматоз-

ний стан, загибель

Вірус менінго-

енцефаліту індиків

і/ц Симптоми ураження ЦНС, загибель

Білі щури

Вірус хвороби Ауєскі п/ш, і/н Паралічі, загибель

Вірус ефемерної гаря-

чки ВРХ

і/ц Збудження, пригнічення, атаксія,

параліч задніх кінцівок, відставання

в рості, загибель

Вірус хвороби Акабане і/ц Втрата рефлексу ссання, паралічі,

загибель

Вірус лихоманки до-

лини Ріфт

в/ч, в/в, п/ш, в/м,

і/ц

Загибель, некроз печінки, РГА

Вірус грипу свиней і/н Симптоми ураження дихальних шля-

хів, загибель

Вірус Сендай і/н Симптоми ураження дихальних шля-

хів

Вірус японського ен-

цефаліту

і/ц Симптоми енцефаліту, загибель

Вірус західного енце-

фаломієліту коней

і/ц, в/м, в/ч, п/ш Симптоми енцефаломієліту, загибель

Вірус східного енцефа-

ломієліту коней

і/ц Симптоми енцефаліту, загибель

Вірус венесуельського

енцефаломієліту коней

і/ц, в/м, в/ч, п/ш,

і/н

Симптоми енцефаліту, загибель

Вірус інфекційного

бурситу птиці

і/ц Симптоми ураження ЦНС, загибель

Морські свинки

Вірус ящуру в/ш Афти на лапках і слизовій оболонці

ротової порожнини

Вірус везикулярного

стоматиту

в/ш Везикули на лапках і язиці

Вірус виразкового ма-

міліту ВРХ

в/ш Некроз шкіри

Вірус нодулярного

дерматиту ВРХ

в/ш Внутрішньошкірні некротичні вузли-

ки

Вірус енцефало-

міокадиту

і/н, в/ч Скуйовдження шерсті, парез задніх

кінцівок, загибель

Розділ 11

Продовження табл. 3

Вірус

Метод

зараження

Ознаки розмноження вірусу

Вірус Сендай і/н

Симптоми ураження дихальних шля-

хів

Вірус японського ен-

цефаліту

і/ц Симптоми енцефаліту, загибель

Вірус ринопневмонії

коней

в/ч

Аборт або загибель, некрози в печін-

ці, крововиливи в легенях, гастроен-

терит

Вірус африканської

чуми коней

і/ц Парези, паралічі, загибель

Вірус західного енце-

фаломієліту коней

і/ц, в/м, в/ч, п/ш Симптоми енцефаломієліту, загибель

Вірус східного енцефа-

ломієліту коней

і/ц Симптоми енцефаліту, загибель

Вірус венесуельського

енцефаломієліту коней

і/ц, в/м, в/ч, п/ш,

і/н

Симптоми енцефаліту, загибель

Вірус інфекційного

гепатиту собак

п/ш Симптоми пневмонії, загибель

Кролі

Вірус сказу і/ц Паралічі, загибель

Вірус хвороби Ауєскі п/ш, в/м

Збудження, свербіння, розчухи, па-

ралічі, загибель

Вірус ящуру п/ш, в/ч

Парези, паралічі, загибель, некроз

скелетних м’язів і міокарда

Вірус везикулярного

стоматиту

у слизову оболо-

нку язика

Везикули на слизовій оболонці рото-

вої порожнини

Вірус виразкового ма-

міліту ВРХ

в/ш Некроз шкіри

Вірус нодулярного

дерматиту ВРХ

в/ш

Внутрішньошкірні некротичні вузли-

ки

Вірус віспи корів

в/ш, у скарифі-

ковану шкіру

Інфільтрати з некрозом і геморагія-

ми, папули, пустули на шкірі

Вірус вісповакцини

в/ш, у скарифі-

ковану шкіру

Інфільтрати, папули, пустули на

шкірі

Вірус контагіозної ек-

тими овець і кіз

у скарифіковану

шкіру

Гіперемія, припухлість і папули на

шкірі

Вірус західного енце-

фаломієліту коней

і/ц, в/м, в/ч, п/ш Симптоми енцефаломієліту, загибель

Вірус східного енцефа-

ломієліту коней

і/ц Симптоми енцефаліту, загибель

Вірус венесуельського

енцефаломієліту коней

і/ц, в/м, в/ч, п/ш,

і/н

Симптоми енцефаліту, загибель

Вірус віспи кролів

в/ш, у скарифі-

ковану шкіру

Набряк і некроз шкіри

Вірус фіброми Шоупа п/ш

Пухлини на шкірі з геморагіями і

некрозом, ерозії, струпи, рубці

Вірус міксоматозу кро-

лів

в/ш, у кон’юнк-

тивальний мі-

шок

Блефарокон’юнктивіт, риніт, пухлин-

ні вузлики або драглисті набряки на

шкірі

Лабораторна діагностика вірусних хвороб

Закінчення табл. 3

Вірус

Метод

зараження

Ознаки розмноження вірусу

Хом’яки

Вірус папіломи ВРХ п/ш Пухлини

Аденовірус ВРХ п/ш, в/ч, і/ц, у

грудну порожни-

ну

Пухлини

Вірус ефемерної гаря-

чки ВРХ

і/ц Збудження, пригнічення, атаксія,

параліч задніх кінцівок, відставання

в рості, загибель

Вірус лихоманки до-

лини Ріфт

в/ч, в/в, п/ш, в/м,

і/ц

Загибель, некроз печінки, РГА

Вірус інфекційної ка-

таральної гарячки

овець

і/ц Симптоми енцефаліту, загибель

Вірус шотландського

енцефаломієліту овець

і/ц Скуйовдження шерсті, в’ялість, збу-

дження, тремор, порушення коорди-

нації рухів, судоми, парез кінцівок,

загибель

Вірус енцефало-

міокардиту

і/н, в/ч Скуйовдження шерсті, парез задніх

кінцівок, загибель

Вірус грипу свиней і/н Симптоми ураження дихальних шля-

хів, загибель

Вірус Сендай і/н Симптоми ураження дихальних шля-

хів

Вірус японського ен-

цефаліту

і/ц Симптоми енцефаліту, загибель

і/ц Симптоми енцефаломієліту, загибель Вірус ринопневмонії

коней

і/н, п/ш, в/ч Загибель, гепатит

Вірус західного енце-

фаломієліту коней

і/ц, в/м, в/ч, п/ш Симптоми енцефаломієліту, загибель

Вірус східного енцефа-

ломієліту коней

і/ц Симптоми енцефаліту, загибель

Вірус венесуельського

енцефаломієліту коней

і/ц, в/м, в/ч, п/ш,

і/н

Симптоми енцефаліту, загибель

Аденовірус собак п/ш Пухлини

Аденовірус птиці

(СЕLО)

п/ш Пухлини

Вірус саркоми Рауса п/ш Пухлини

Вірус інфекційної бур-

ситу птиці

і/ц Симптоми ураження ЦНС, загибель

Вірус менінгоенцефа-

літу індиків

і/ц Симптоми ураження ЦНС, загибель

Тхори

Вірус грипу свиней і/н Симптоми ураження дихальних шля-

хів, загибель

Вірус чуми м’ясоїдних орально, п/ш, в/в,

в/м, і/н

Кон’юнктивіт, риніт, діарея, дегідра-

тація, вип’ячування і набряк прямої

кишки, загибель

Розділ 11

Для розтину черевної порож-

нини роблять розріз черевної стін-

ки по середній лінії від симфізу до

мечоподібного відростка, а далі —

під лінією діафрагми. Утворені

трикутники черевної стінки відво-

дять убік і фіксують. Пінцетом

відтягують кишки вліво до появи

паренхіматозних органів. Як віру-

совмісний матеріал використову-

ють шматочки печінки, селезінки,

нирок, брижових лімфатичних ву-

злів, ділянок кишок за наявності

патологоанатомічних змін або з урахуванням клінічних ознак перед

загибеллю. У дрібних тварин беруть цілі органи.

При розтині грудної порожнини розрізають ребра і видаляють їх

разом із грудною кісткою. Для дослідження беруть легені, середо-

стінні лімфатичні вузли, трахею.

Для розтину черепної порожнини тварину кладуть на черево, фік-

сують передні кінцівки і голову (рис. 67). Розріз шкіри роблять у ді-

лянці шиї та в напрямку до очниць. Шкіру разом із вухами препару-

ють і стягують уперед, оголюючи черепну коробку. Розріз черепної

коробки проводять від великого мозкового отвору в напрямку до оч-

ниць. Потім розрі-

зають черепну кіс-

тку між очницями

і видаляють усю

вирізану ділянку.

У великих тварин

кістки черепа

розпилюють. З

основи черепа

дістають головний

мозок, підрізавши підрізавши черепномозкові нерви.

Патологічний матеріал від заражених лабораторних тварин бе-

руть згідно з тропізмом вірусу і використовують для ідентифікації

виділеного збудника. Матеріал зберігають у замороженому стані

при –20…–70 °С.

ВИДІЛЕННЯ ВІРУСІВ НА КУРЯЧИХ ЕМБРІОНАХ

У вірусологічній практиці для виділення вірусів із патологічного

матеріалу використовують курячі ембріони, які мають ряд істотних

переваг порівняно з лабораторними тваринами. Їм властива висока

чутливість до вірусів, що пояснюється недостатнім розвитком захис-

Рис. 66. Розтин черевної

та грудної порожнин миші

(М.І. Троценко та ін., 1989)

Рис. 67. Розтин черепної порожнини миші

(М.І. Тр

оценко та ін., 1989)

Лабораторна діагностика вірусних хвороб

них механізмів. Курячі ембріони стерильні та дають більший вихід

вірусу, а також економічні й доступні для будь-якої вірусологічної

лабораторії. Разом з тим, не можна повністю гарантувати стериль-

ність цієї живої системи, оскільки курячі ембріони від зараженої

птиці можуть містити різні патогенні агенти (віруси лейкозу, сар-

коми Рауса, ньюкаслської хвороби, грипу, парагрипу-2, інфекційно-

го бронхіту, інфекційного ларинготрахеїту, енцефаломієліту, віспи,

аденовіруси, мікоплазми, сальмонели).

Для зараження використовують курячі ембріони віком від 5 до 12

діб із благополучних щодо інфекційних захворювань господарств.

Ембріони старшого віку менш чутливі до вірусів, що пов’язано з під-

вищенням у них концентрації неспецифічних вірусних інгібіторів.

Будову курячого ембріона наведено на рис. 68. Зовні ембріон

вкритий твердою пористою шкаралупою, до якої прилягає підшкара-

лупна оболонка. Біля тупого кінця яйця вона розділяється на два лис-

тки, між якими утворюється повітря-

на камера. До підшкаралупної оболо-

нки прилягає хоріон-алантоїсна обо-

лонка (ХАО), що пронизана кровонос-

ними судинами і виконує функцію

органа дихання ембріона. ХАО обме-

жує алантоїсну порожнину, в якій

нагромаджуються продукти обміну

(сечокислі солі, фосфорні й азотисті

сполуки). Зародок знаходиться в яйці

ексцентрично, спиною ближче до

шкаралупи, голова спрямована в бік

повітряної камери. Він лежить в ам-

ніотичній порожнині, що заповнена

навколоплідною рідиною та оточена

оболонкою. Зародок пуповиною зв’яза-

ний із жовтковим мішком, що є ре-

зервуаром поживних речовин. У гост-

рому кінці яйця знаходиться залишок

білка, який містить лізоцим, що за-

хищає зародок від стафілококової та

інших інфекцій.

Залежно від тропізму віруси можуть репродукуватися в клітинах

тіла зародка, амніона, ХАО і жовткового мішка, де нагромаджуються

в найбільшій концентрації. Водночас багато вірусів здатні накопичу-

ватися в алантоїсній та амніотичній рідинах. Зараження в ту чи ін-

шу структуру курячого ембріона проводять у період її максимального

розвитку, коли кількість клітин є найбільшою. У процесі розвитку

ембріона змінюються розміри його структур, що потрібно враховувати

при визначенні віку ембріона, оптимального для зараження.

Рис. 68. Будова курячого ембрі-

она 10-денного віку (Ш.С. Ніко-

лау та ін., 1965)

1 — шкаралупа; 2 — підшкаралуп-

на оболонка; 3 — жовтковий мішок;

4 — алантоїсна порожнина; 5 — хо-

ріон-алантоїсна оболонка; 6 — білок;

7 — амніотична порожнина; 8

—

тіло зародка; 9 — повітряна камера

Розділ 11

У лабораторії курячі ембріони інкубують у термостаті за темпе-

ратури +37 °С, вологості 60 – 70 % і відкритих вентиляційних отво-

рах. Перед зараженням курячі ембріони розглядають на овоскопі в

темному приміщенні. При цьому встановлюють їхню життєздат-

ність: судини ХАО наповнені кров’ю, зародок рухомий. На шкара-

лупі простим олівцем відмічають межу повітряної камери і місце-

знаходження зародка. Шкаралупу перед зараженням обробляють

2%-м спиртовим розчином йоду, а іноді ще й протирають запаленим

спиртовим тампоном.

Методи експериментального зараження курячих ембріо-

нів. Розроблено шість методів експериментального зараження

курячих ембріонів:

1) в алантоїсну порожнину (9 – 11-й день інкубації);

2) на ХАО (10 – 12-й день інкубації);

3) у жовтковий мішок (5 – 7-й день інкубації);

4) в амніотичну порожнину (6 – 10-й день інкубації);

5) у тіло зародка (7 – 12-й день інкубації);

6) у судини ХАО (11 – 12-й день інкубації).

Останні два методи використовуються нечасто. Інокуляція інфек-

ційного матеріалу в тіло зародка часто супроводжується неспецифіч-

ною загибеллю внаслідок травмування. Зараження в судини ХАО є

технічно складним методом.

Вибір методу зараження курячих ембріонів визначається тропізмом

вірусу. Кожною пробою дослідного матеріалу заражають не менше

чотирьох ембріонів в дозі 0,1 – 0,2 см

(незалежно від способу інокуля-

ції).

Зараження в алантоїсну порожнину (два способи, рис. 69):

1) Ембріон роз-

міщують вертика-

льно. У шкаралупі

роблять отвір на 5 –

6 мм вище межі по-

вітряної камери.

Голку вводять вер-

тикально на гли-

бину 10 – 12 мм. Пі-

сля внесення віру-

совмісного матеріа-

лу отвір закривають

краплею розплав-

леного парафіну.

2) Ембріон роз-

міщують горизон-

тально. На бічній

поверхні шкаралу-

Рис. 69. Зараження курячого ембріона в алантоїсну

порожнину (Ш.С. Ніколау та ін., 1965)

Лабораторна діагностика вірусних хвороб

пи роблять отвір (попередньо на овоскопі вибирають ділянку ХАО

без судин) і вводять голку на глибину 2 – 3 мм. Щоб рідина не виті-

кала, потрібно зробити ще один отвір над повітряною камерою. Піс-

ля зараження отвори закривають парафіном.

Зараження на ХАО (два способи, рис. 70):

1) Через природну повітряну камеру. Ембріон розміщують вер-

тикально. У шкаралупі над повітряною камерою вирізають отвір

діаметром 1,5 – 2 см. Пінцетом обережно знімають підшкаралупну

оболонку, не пошкоджуючи ХАО, і наносять вірусовмісний матеріал.

Отвір закривають лейкопластиром.

2) Через штучну повітряну камеру. Ембріон розміщують гори-

зонтально. У шкаралупі роблять два отвори: один невеликий — над

центром повітряної камери, а другий, завдовжки 6 – 8 мм і зав-

ширшки 2 мм — на бічній поверхні над безсудинною ділянкою ХАО,

яку попередньо вибирають на овоскопі.

Зараження в жовтковий мішок (два способи, рис. 71):

1) Ембріон розміщують вертикально. Роблять отвір у шкаралупі

над центром повітряної камери. Голку вводять на глибину 3,5 – 4 см

під кутом 45° до вертикальної осі в напрямку, протилежному місце-

знаходженню зародка. Після інокуляції вірусовмісного матеріалу

отвір закривають парафіном.

Рис. 70. Зараження

курячого ембріона

на ХАО

(Ш.С. Ніколау та ін.,

1965)

Розділ 11

2) Ембріон розміщують горизонтально так, щоб жовтковий мішок

був угорі, а зародок

— внизу. Отвір ро-

блять у шкаралупі

з боку жовткового

мішка на середині

довжини яйця. Го-

лку вводять верти-

кально на глибину

1 см. Після зара-

ження отвір закри-

вають парафіном.

Зараження в

амніотичну по-

рожнину (два

способи, рис. 72):

1) Ембріон роз-

міщують вертика-

льно. Роблять отвір

у шкаралупі над

центром повітряної камери. Голку вводять на глибину 3,5 – 4 см під

кутом 45° до вертикальної осі в напрямку, протилежному місцезнахо-

дженню зародка. Після інокуляції вірусовмісного матеріалу отвір за-

кривають парафіном.

2) Ембріон розміщують горизонтально так, щоб жовтковий мішок

був угорі, а зародок — внизу. Отвір роблять у шкаралупі з боку жовт-

кового мішка на середині довжини яйця. Голку вводять вертикально

на глибину 1 см. Після зараження отвір закривають парафіном.

Зараження в тіло зародка (два способи):

1) Заражають так

само, як в амніон

закритим способом,

із тією різницею, що

беруть гостру голку.

Ознакою того, що

голка потрапила в

тіло зародка, є під-

корення зародка

рухам голки.

2) Заражають так

само, як в амніон

відкритим способом.

Через отвір у шка-

ралупі підтягують

зародок. Голку вво-

Рис. 71. Зараження курячого ембріона в жовтковий

мішок (Ш.С. Ніколау та ін., 1965)

Рис. 72. Зараження курячого ембріона в амніотичну

порожнину (Ш.С. Ніколау та ін., 1965)