Калинина О.С., Паникар И.И., Скибицкий В.Г. Ветеринарная вирусология

Подождите немного. Документ загружается.

Лабораторна діагностика вірусних хвороб

дять у різні ділянки тіла зародка або в головний мозок.

Зараження в судини ХАО (два способи):

1) Зараження проводять на овоскопі. Вибирають велику судину,

по ходу якої обережно видаляють невелику ділянку шкаралупи. На

підшкаралупну оболонку наносять краплю спирту, оболонка стає

прозорою. Тонку голку вводять у судину, що підтверджується її рух-

ливістю при незначних бокових рухах голки. Після введення віру-

совмісного матеріалу отвір закривають лейкопластиром.

2 Ембріон розміщують вертикально, зрізають шкаралупу над по-

вітряною камерою. На підшкаралупну оболонку наносять кілька

крапель спирту, оболонка стає прозорою. Вибирають велику судину і

вводять вірусовмісний матеріал. Отвір закривають лейкопластиром.

Індикація вірусів у курячих ембріонах. Заражені ембріони

підписують простим олівцем, кладуть у термостат і щодня розгля-

дають на овоскопі. Ембріони, що загинули, переносять у холодиль-

ник і витримують 16 – 18 год при +4 °С або 1 – 2 год при –10…–20 °С.

Це значно полегшує їхній наступний розтин унаслідок ущільнення

тканин і звуження судин та дає можливість одержати чисті ембріо-

нальні рідини. Загибель ембріонів у перші 24 год після зараження

зумовлена найчастіше бактеріальним чи грибним забрудненням

при нестерильній роботі або травмуванням зародка при зараженні.

Така загибель вважається неспецифічною. Проте існують віруси, які

можуть спричинити швидку загибель ембріонів (наприклад, висо-

Рис. 73. Розтин курячого ембріона (Ш.С. Ніколау та ін., 1965)

1 — одержання алантоїсної рідини; 2 — одержання амніотичної рідини;

3 — одержання тіла зародка

Розділ 11

ковірулентні штами вірусів грипу птиці або ньюкаслської хвороби).

Якщо ембріони не гинуть, їх інкубують до моменту максимального

нагромадження збудника (кожний вірус має певний цикл репроду-

кції), а потім умертвляють і розтинають (рис. 73).

Розтин курячих ембріонів проводять у стерильних умовах із ме-

тою відбору вірусовмісного матеріалу та аналізу патологоанатоміч-

них змін. Як вірусовмісний матеріал можуть бути використані алан-

тоїсна й амніотична рідини, ХАО, жовтковий мішок, тіло зародка

(залежно від тропізму вірусу).

Шкаралупу протирають 2%-м спиртовим розчином йоду і зріза-

ють вище межі повітряної камери. Проколюють підшкаралупну

оболонку разом із ХАО (в безсудинній ділянці), пінцетом притри-

мують структури ембріона і пастерівською піпеткою відбирають до

10 см

алантоїсної рідини. Пінцетом піднімають верхню частину

ХАО, зрізають ножицями і вміщують у чашку Петрі з 0,9%-м розчи-

ном NaCl. Виймають зародок, підтримуючи його за шию та відділя-

ючи від пупкового канатика. Жовтковий мішок і білок вносять у

чашку Петрі. Частину ХАО, що залишилася на шкаралупі, вийма-

ють пінцетом, вміщують у чашку Петрі з 0,9%-м розчином NaCl,

промивають до одержання прозорої рідини, розправляють двома

пінцетами і розглядають на темному фоні. Двома пінцетами беруть

жовтковий мішок, витискають його вміст, переносять у чашку Петрі

з 0,9%-м розчином NaCl і промивають.

Вірусовмісний матеріал, одержаний при розтині курячих ембріо-

нів, перевіряють на стерильність (посіви на МПА, МПБ, МППБ, се-

редовище Сабуро) і використовують для ідентифікації виділеного

збудника. Зберігають матеріал при –20…–70 °С.

Ознаками розмноження вірусів у курячих ембріонах є загибель

(у характерні для кожного виду вірусу строки), патологоанатомічні

зміни і гемаглютинація з ембріональними рідинами (табл. 4). З па-

тологоанатомічних змін найтиповішими є помутніння і набряк

ХАО, утворення на ХАО некротичних вузликів — віспин (рис. 74,

75), осередків клітинної проліферації — пустул, чи бляшок (рис. 76),

гіперемія, крововиливи і набряки на тілі зародка, карликовість і

муміфікація зародка (рис. 77), осередки некрозу в паренхіматозних

органах, зміна кольору печінки.

Таблиця 4. Культивування вірусів на курячих ембріонах

Вірус

Метод

зараження

Ознаки розмноження вірусу

Поксвіруси

Вірус віспи корів на ХАО, в

алантоїсну

порожнину

Загибель, геморагічні віспини на

ХАО

Вірус віспи овець на ХАО Віспини на ХАО

Вірус віспи кіз на ХАО Віспини на ХАО

Лабораторна діагностика вірусних хвороб

Продовження табл. 4

Вірус

Метод

зараження

Ознаки розмноження вірусу

Вірус віспи кролів на ХАО Загибель, геморагічні віспини на

ХАО, крововиливи на тілі зародка

Вірус віспи птиці на ХАО Загибель, віспини на ХАО

Вірус нодулярного

дерматиту ВРХ

на ХАО Віспини на ХАО

Вірус вісповакцини на ХАО Загибель, віспини на ХАО

Вірус міксоматозу кролів на ХАО Віспини на ХАО

Герпесвіруси

Вірус хвороби Ауєскі на ХАО Загибель, віспини на ХАО

Вірус ринопневмонії

коней

у жовтковий мі-

шок, в аланто-

їсну порожнину,

в амніон

Загибель, віспини на ХАО

Вірус хвороби Марека на ХАО, в

жовтковий

мішок

Загибель, вогнища проліферації на

ХАО (пустули, або бляшки),

збільшення печінки і селезінки

Вірус інфекційного

ларинготрахеїту птиці

на ХАО Загибель, некротично-вогнищеві та

дрібновузликові ураження ХАО

Аденовіруси

Аденовіруси птиці

(CELO, GAL)

на ХАО, в

судини ХАО, в

алантоїсну

порожнину, в

жовтковий

мішок

Загибель, гіперемія, крововиливи,

карликовість або кучерявість

зародка; набряк, помутніння і

некротичні вогнища на ХАО; некроз

печінки, збільшення об’єму

алантоїсної рідини, зменшення об’єму

амніотичної рідини; РГА

Папіломавіруси

Вірус папіломи ВРХ на ХАО Епітеліальні потовщення ХАО

Параміксовіруси

Вірус парагрипу-3 ВРХ в алантоїсну

порожнину, в

амніон, на ХАО

РГА

Вірус Сендай в алантоїсну по-

рожнину, в ам-

ніон, у жовт-

ковий мішок

Загибель, РГА

Вірус чуми м’ясоїдних в алантоїсну по-

рожнину, на

ХАО, в жовт-

ковий мішок

Загибель, помутніння ХАО

Вірус ньюкаслської

хвороби

в амніотичну

порожнину, в

амніон, на ХАО

Загибель, крововиливи на тілі

зародка, РГА

Параміксовіруси птиці в алантоїсну

порожнину

Загибель, РГА

Рабдовіруси

Вірус везикулярного

стоматиту

на ХАО Загибель, віспини на ХАО

Вірус грипу свиней в алантоїсну

порожнину, в

амніон

Крововиливи на тілі зародка, РГА

Розділ 11

Продовження табл. 4

Вірус

Метод

зараження

Ознаки розмноження вірусу

Вірус грипу коней

в алантоїсну

порожнину, в

амніон

РГА

Ортоміксовіруси

Вірус грипу птиці

в алантоїсну

порожнину, в

амніон

Загибель, крововиливи на тілі

зародка, РГА

Вірус грипу качок

в алантоїсну

порожнину, на

ХАО

Загибель, гіперемія та крововиливи

на тілі зародка, РГА

Буньявіруси

Вірус хвороби Акабане

у жовтковий

мішок

Загибель, потворність кінцівок,

водянка головного мозку

Вірус лихоманки долини

Ріфт

у жовтковий

мішок

Загибель, РГА

Тогавіруси

Віруси енцефаломієлітів

коней (західного,

східного і

венесуельського)

на ХАО, в

алантоїсну

порожнину, в

амніон, у

жовтковий

мішок

Загибель, РГА

Флавівіруси

Вірус діареї ВРХ

у жовтковий

мішок

Загибель

Вірус японського

енцефаліту

на ХАО, в

жовтковий

мішок

Загибель, РГА

Вірус

менінгоенцефаліту

індиків

у жовтковий

мішок

Загибель, РГА

Вірус шотландського

енцефаломієліту овець

на ХАО, в

жовтковий

мішок

Загибель, дрібновогнищеві

помутніння ХАО, набряк ХАО та

амніотичної оболонки, тіла зародка,

некроз печінки, ознаки жовтяниці

(ембріональні рідини, вміст

кишечнику і жовткового мішка

зеленого кольору)

Пікорнавіруси

Вірус інфекційного

енцефаломієліту птиці

в алантоїсну

порожнину, в

амніон,

у жовтковий

мішок

Загибель, атрофія м’язів, водянка

головного мозку

Вірус гепатиту каченят

на ХАО, в

алантоїсну

порожнину

Загибель, набряки, гіперемія та

крововиливи на тілі зародка, набряк

ХАО і печінки, печінка жовто-сірого

або жовто-зеленого кольору з

вогнищами некрозу, ознаки

жовтяниці (ембріональні рідини,

вміст кишечнику і жовткового мішка

зеленого кольору)

Лабораторна діагностика вірусних хвороб

Закінчення табл. 4

Вірус

Метод

зараження

Ознаки розмноження вірусу

Коронавіруси

Вірус інфекційного

бронхіту птиці

в алантоїсну

порожнину, в

амніон, на ХАО

Загибель, карликовість і муміфікація

зародка, набряк ХАО та амніотичної

оболонки, збільшення об’єму

алантоїсної рідини, зменшення

об’єму амніотичної рідини,

зморщування жовткового мішка, РГА

Ретровіруси

Вірус саркоми Рауса на ХАО, в

амніон, у

судини ХАО

Вогнища проліферації на ХАО

(бляшки)

Вірус лімфоїдного

лейкозу птиці

у жовтковий

мішок

Лімфоматоз

Вірус еритробластозу

птиці

на ХАО Еритробластоз

Вірус мієлобластозу

птиці

у судини ХАО Мієлобластоз

Реовіруси

Вірус інфекційної

катаральної гарячки

овець

у жовтковий

мішок, на ХАО,

в судини ХАО

Загибель, зародок вишнево-

червоного кольору з множинними

крововиливами

Вірус африканської

чуми коней

на ХАО Загибель

Реовіруси птиці у жовтковий

мішок

Загибель, крововиливи на тілі

зародка, некроз ХАО, печінки і

селезінки

Бірнавіруси

Вірус інфекційного

бурситу птиці

на ХАО, в

жовтковий

мішок, в

алантоїсну

порожнину

Загибель, гіперемія, крововиливи,

набряки і карликовість зародка,

некротичні вогнища в печінці,

селезінці й нирках

Рис. 74. Віспини на ХАО курячих ембріонів, заражених вірусами віспи ку-

рей (а), віспи корів (б) і хвороби Ауєскі (в) (В.М. Сюрін та ін., 1991)

Розділ 11

300

Важливим методом індикації

вірусів у курячих ембріонах є ре-

акція гемаглютинації (РГА), що

ґрунтується на здатності вірусів

склеювати еритроцити певного виду. Ця властивість зумовлена на-

явністю у вірусів білка гемаглютиніну, за рахунок якого вони адсор-

буються на поверхні еритроцитів. Один віріон приєднується одноча-

сно до двох еритроцитів, і вони склеюються у вигляді пластівців,

видимих неозброєним оком. РГА використовується для індикації в

курячих ембріонах гемаглютинувальних вірусів (грипу ссавців і

птахів, ньюкаслської хвороби, інфекційного бронхіту птиці, параг-

рипу-3 ВРХ, чуми м’ясоїдних та ін.). Особливо цінна ця реакція при

виявленні вірусів, які розмножуються в курячих ембріонах, але не

Рис. 75. Дрібновузликові (а) та некротично-осередкові (б) ураження ХАО

курячих ембріонів, заражених вірусом інфекційного ларинготрахеїту пти-

ці (Н.В. Ліхачов та ін., 1973)

Рис. 76. Пустули (бляшки) на ХАО

курячого ембріона, зараженого

вірусом хвороби Марека

(В.М. Сюрін та ін., 1998)

а б

Рис. 77. Курячі ембріони 16-денного

віку (В.М. Сюрін та ін., 1998):

а — незаражений; б — заражений віру-

сом інфекційного бронхіту птиці

Лабораторна діагностика вірусних хвороб

301

спричинюють жодних змін (наприклад, віруси грипу коней, параг-

рипу-3 ВРХ, слабовірулентні штами вірусу ньюкаслської хвороби).

Для постановки РГА на склі змішують краплю ембріональної ріди-

ни (алантоїсної або амніотичної) з краплею 5%-ї суспензії еритроци-

тів певного виду. За наявності гемаглютинувального вірусу через

5 – 10 хв випадають пластівці склеєних еритроцитів.

ВИДІЛЕННЯ ВІРУСІВ У КУЛЬТУРАХ КЛІТИН

Найдосконалішою моделлю для виділення вірусів із патоло-

гічного матеріалу є культура клітин. Вона знімає видові обмеження

культивування вірусів, оскільки in vitro можна вирощувати будь-які

клітини різних видів тварин. Немає єдиної клітинної культури, яка

була б придатною для виділення будь-якого вірусу. Тому в лабора-

торній діагностиці зазвичай застосовують кілька видів культур

залежно від того, який вірус передбачається виділити.

У вірусологічній практиці найчастіше використовують одноша-

рову (моношарову) культуру клітин. Це клітини in vitro, одер-

жані в результаті диспергування тканин, які прикріплюються до

субстрату і розмножуються, утворюючи моношар (на склі пробірок,

флаконів, матраців). Одношарові культури клітин поділяються на

первинні, субкультури, перещеплювані й диплоїдні.

Первинні (або первинно-трипсинізовані) культури клі-

тин одержують з органів і тканин, що взяті безпосередньо з органі-

зму. Для отримання первинної культури клітин можна використо-

вувати різноманітні тканини, як ембріонів, так і дорослих тварин.

Вибір клітин для культивування визначається їхньою чутливістю

до того чи іншого вірусу. Прямої залежності між сприйнятливістю

тварин in vivo і чутливістю клітин їхніх тканин in vitro до вірусів не

спостерігається. Разом з тим, адаптація вірусів до первинної куль-

тури проходить успішніше, якщо вона одержана з органів тварини,

природно сприйнятливої до певного вірусу. Краще культивуються in

vitro клітини ембріональних тканин, а також тварин раннього віку,

оскільки вони мають вищу потенцію росту.

Для отримання первинної культури клітин від здорової твари-

ни не пізніше 2 – 3 год після забою беруть відповідні органи або

тканини, наприклад, нирки, сім’яники, легені, шкіру. Подрібнюють

ножицями на шматочки розміром 2 – 5 мм, промивають кілька разів

розчином Хенкса до одержання прозорої рідини й обробляють про-

теолітичним ферментом, найчастіше 0,25%-м розчином трипсину,

для дезагрегації тканини. Трипсинізацію проводять на магнітній

мішалці дробно за температури +37 °С 3 – 5 разів по 5 – 30 хв (за-

лежно від виду тканини до повного її виснаження) або за +4…+6 °С

12 – 16 год. Фермент руйнує міжклітинні речовини, і тканина дис-

пергується на окремі клітини. Трипсин із клітинами, що відділили-

Розділ 11

302

ся, зливають у центрифужні пробірки, дію ферменту при методі теп-

лої трипсинізації припиняють охолодженням або додаванням 2 – 4 %

сироватки крові ВРХ і центрифугують при 1000 об/хв 10 – 15 хв.

Трипсин видаляють, осад клітин розводять невеликою кількістю

ростового середовища (середовище 199, середовище Ігла або 0,5%-й

гідролізат лактоальбуміну з додаванням 2 – 10 % сироватки крові

ВРХ), фільтрують через 2 – 3 шари марлі. Після підрахунку кілько-

сті клітин у камері Горяєва

суспензію розводять ростовим середо-

вищем до оптимальної посівної концентрації (200 – 500 тис. клітин

у 1 см

), розливають по пробірках (по 1 см

) або матрацах (10 – 15 %

від об’єму), вміщують у термостат при +37 °С.

У своєму розвитку культура клітин проходить три фази. Перша

фаза — адаптації, триває 2 – 24 год і характеризується адгезією

клітин, тобто прикріпленням їх до скла. Друга фаза — логарифміч-

ного росту, супроводжується поділом клітин, які поступово покри-

вають поверхню скла. Третя фаза — стаціонарна, характеризується

формуванням через 3 – 5 діб моношару внаслідок контактної інгі-

біції клітин, тобто припинення їхнього поділу при контакті (рис. 78,

79). Швидкість утворення моношару на склі залежить від виду тка-

нини, віку тварини, якості живильного середовища, посівної конце-

нтрації клітин та інших факторів. Після сформування моношару

ростове середовище змінюють на підтримувальне (без сироватки

Підрахунок кількості клітин у камері Горяєва: до 1 см

суспензії клітин дода-

ють 1 см

0,1%-го розчину кристалвіолету (на 0,1 н розчині лимонної кислоти), пере-

мішують, заповнюють камеру Горяєва і підраховують у двох камерах нефарбовані

клітини з чіткими контурами та ядрами. Кількість клітин у 1 см

суспензії (Х) визна-

чають за формулою:

2 1000

0,9

⋅⋅

де А — середня кількість клітин в одній камері; 2 — коефіцієнт розведення суспензії;

1000 — кількість мм

у 1 см

; 0,9 — об’єм камери Горяєва в мм

Рис. 78. Первинні культури клітин сім’яників теляти (а) і легень ембріона

вівці (б) (М.І. Троценко та ін. 1989)

Лабораторна діагностика вірусних хвороб

303

крові ВРХ). Моношар зберігає життєздатність упродовж 1 – 3 тижнів

(при періодичній зміні середовища, яке забруднюється продуктами

метаболізму клітин). З часом клітини старіють, і настає їхня неспе-

цифічна дегенерація: вони округлюються, відриваються від скла і

гинуть.

Первинні культури не мають багатьох клітин, які присутні у ви-

хідній тканині, оскільки не всі клітини здатні прикріпитися до суб-

страту і вижити в умовах in vitro. Однак клітини первинних куль-

тур гетерогенні, й у них найповніше представлені типи клітин тієї

тканини, звідки вони одержані. Первинні культури високочутливі

до вірусів, онкогенно безпечні. Недоліком їх є значна трудомісткість

одержання, а також можливість контамінації латентними вірусами

і мікоплазмами, що персистують в організмі тварин, тканини яких

використовують для трипсинізації.

Субкультури (або вторинні культури клітин) одержують із

первинних, вирощених у матрацах, після формування моношару.

Клітини знімають зі скла 0,25%-м розчином трипсину або 0,02%-м

розчином версену (експозиція 15 – 30 хв при +37 °С до появи пер-

ших ознак відшарування клітин), ресуспендують у ростовому живи-

льному середовищі до посівної концентрації й пересівають у матра-

ци або пробірки. Через 2 – 3 доби формується моношар вторинної

культури клітин (рис. 80).

За чутливістю до вірусів субкультури не відрізняються від пер-

винних. Проте при субкультивуванні кількість клітин збільшується

у 2 – 2,5 рази. Крім того, з’являється можливість виявити контамі-

націю клітин вірусами і мікоплазмами, а також отримати однорід-

нішу популяцію клітин. Субкультури можна одержати при 2 – 5 пе-

ресівах, зрідка — до 8 – 10. Наступні пасажі призводять до зміни

морфології клітин та їхньої загибелі. Якщо клітинні культури

пройшли понад 10 пасажів, вони перебувають на стадії переходу до

диплоїдних або перещеплюваних.

Рис. 79. Первинна культура

клітин нирок свині

(В.М. Сюрін та ін., 1984)

Рис. 80. Субкультура фібробластів

курячого ембріона

(В.М. Сюрін та ін., 1984)

Розділ 11

304

Перещеплювані культури клітин (син.: стабільні, або по-

стійні, клітинні лінії) одержують із первинних шляхом трива-

лих пересівів (не менш як 70 разів із триденними інтервалами). Та-

кі клітини, як правило, мають змінений каріотип порівняно з вихі-

дною культурою (гетероплоїдний набір хромосом), необмежений

строк життя, і багато з них виявляють онкогенні властивості.

Одержання перещеплюваних культур клітин — досить рідкісне

явище. Перещеплювані клітинні лінії вдається отримати з популяції

клітин первинних культур, які мають підвищену активність росту і

розмноження. Відносно причин появи перещеплюваних клітин існу-

ють різні точки зору. Зокрема, вважають, що такі клітини з’являються

в результаті мутацій або активізації клітинних онкогенів.

Перещеплювані культури клітин можна одержати як із норма-

льних, так і пухлинних тканин тварин і людини. Серед них широко

застосовуються такі клітинні лінії, як HeLa (з карциноми шийки

матки жінки), Нер-2 (з карциноми гортані людини), КВ (з карци-

номи ротової порожнини

людини), L (з підшкірної

сполучної тканини миші),

ВНК-21 (з нирки сирійсь-

кого хом’яка), Vero (з нир-

ки африканської зеленої

мавпи) та багато інших

(рис. 81).

Перещеплювані куль-

тури клітин мають переваги

порівняно з первинними.

Їхнє застосування вирішує

проблему сировини, виклю-

чає потребу постійного по-

стачання свіжими ткани-

нами. Перещеплювані

культури складаються з

відносно однорідних клітин

(епітеліоїдних, фібробласто-

їдних), що забезпечує стан-

дартні умови репродукції

вірусів. Окрім того, при пе-

ресівах з’являється можли-

вість виявити контамінацію

культури вірусами і мікоп-

лазмами. Проте перещеп-

лювані культури мають се-

рйозний недолік: схильність

до малігнізації, тобто зло-

якісного переродження.

Рис. 81. Перещеплювані культури клітин L

(а), Hela (б) і КВ (в) (Г. Штарке та ін., 1970)