Калинина О.С., Паникар И.И., Скибицкий В.Г. Ветеринарная вирусология

Подождите немного. Документ загружается.

Лабораторна діагностика вірусних хвороб

лізис суперкапсидної оболонки віріонів. Найкращого зображення

структури віріонів та їхньої агрегації досягають за оптимальної

концентрації антитіл, яку підбирають дослідно із різними розбав-

ляннями сироватки.

Препарати для ІЕМ готують так. Дослідну вірусовмісну суспен-

зію змішують із специфічною сироваткою у співвідношенні 4 : 1 або

5 : 1, витримують 1 год при +37 ºС і 16 – 18 год при +4 ºС, потім

центрифугують при 10 – 15 тис. об/хв для осадження імунних ком-

плексів. Осад ресуспендують у кількох краплях дистильованої води,

адсорбують на предметну сітку і контрастують.

Метод ІЕМ використовують не тільки для індикації та ідентифі-

кації вірусів у дослідному матеріалі, а й для їхньої серотипізації, а

також з метою виявлення і титрування антитіл у сироватках рекон-

валесцентів.

ВИЯВЛЕННЯ ТІЛЕЦЬ-ВКЛЮЧЕНЬ ВІРУСІВ

У патологічному матеріалі хворих і загиблих тварин при бага-

тьох вірусних хворобах виявляють тільця-включення, природа яких

може бути різною залежно від виду вірусу: 1) скупчення віріонів по-

томства; 2) нагромадження вірусних білків, що не увійшли до скла-

ду віріонів потомства; 3) клітинний матеріал, змінений у результаті

репродукції вірусу. Здебільшого тільця-включення є вірусними

«фабриками» — місцями синтезу вірусних білків і нуклеїнових кис-

лот та складання віріонів потомства, включаючи клітинні структури

(наприклад, рибосоми, осміофільні волокна).

Тільця-включення класифікують:

1) за локалізацією в клітині: внутрішньоядерні (типів А і В) і ци-

топлазматичні;

2) за складом нуклеїнової кислоти: ДНК- і РНК-вмісні;

3) за тинкторіальними властивостями: базофільні (фарбуються

основними барвниками) й оксифільні, або ацидофільні (фарбуються

кислими барвниками);

4) за гомогенністю: аморфні, зернисті, гранулярні й волокнисті.

Як правило, ДНК-вмісні віруси утворюють внутрішньоядерні

тільця-включення, а РНК-вмісні — цитоплазматичні. Проте є винят-

ки. Так, ДНК-геномні віруси віспи формують цитоплазматичні тіль-

ця-включення. Невелика група вірусів зумовлює появу тілець-вклю-

чень обох типів (наприклад, віруси чуми ВРХ, парагрипу-3 ВРХ).

Деякі тільця-включення отримали назви на честь авторів, які

вперше виявили їх: при сказі — тільця Бабеша – Негрі, при нату-

ральній віспі й вісповакцині — тільця Гварнієрі, при віспі птиці —

тільця Боллінгера, при інфекційному ларинготрахеїті птиці —

тільця Зейфреда, при чумі м’ясоїдних — тільця Лентца, при ін-

фекційному гепатиті м’ясоїдних — тільця Рубарта.

Розділ 11

Морфологія, тинкторіальні властивості та локалізація тілець-

включень специфічні для кожного вірусу. Тому виявлення їх у па-

тологічному матеріалі хворих або загиблих тварин має діагностичне

значення. Це стосується насамперед такої хвороби, як сказ.

Виявлення тілець Бабеша – Негрі. Тільця Бабеша – Негрі —

це скупчення нуклеокапсидів вірусу сказу (без суперкапсидної обо-

лонки) в поєднанні з продуктами клітинної реакції. Їх виявляють у

цитоплазмі заражених клітин: при буйній формі сказу найчастіше в

клітинах амонових рогів, а при паралітичній формі — в довгастому

і спинному мозку.

Тільця Бабеша – Негрі мають різні розміри (від 0,25 до 25 мкм) і

форму (округла, трикутна, яйце-, грушо-, сигароподібна). Найчастіше

трапляються тільця округлої форми, діаметром від 4 до 10 мкм. Вони

оточені оболонкою та містять зернисті включення (від 1 до 15). У кож-

ному тільці одне або кілька більших зерен займають центральне по-

ложення, а дрібні їх оточують або розміщуються по периферії. Тільця

зафарбовуються кислими фарбами, а їхня внутрішня зернистість —

оснóвними. Така зерниста структура дає змогу диференціювати тільця

Бабеша – Негрі від інших внутрішньоклітинних включень.

Кількість і розміри тілець залежать від тривалості хвороби.

Тільця Бабеша – Негрі з’являються за 3 – 4 доби до появи перших

клінічних ознак хвороби. Чим довший інкубаційний період, тим ін-

тенсивніше вони розвиваються: більші їхня кількість, розміри і чіт-

кіше виражена внутрішня зернистість. Тільця Бабеша – Негрі ви-

являють у 65 – 85 % випадків сказу.

Для індикації в патологічному матеріалі тілець Бабеша – Негрі

готують гістозрізи з різних відділів головного мозку: кора великих

півкуль, мозочок, довгастий мозок, амонів ріг (не менше двох пре-

паратів із кожного відділу). Для виявлення тілець Бабеша – Негрі

використовують різні методи фарбування, найчастіше за Муромце-

вим або Селлером.

Фарбування за Муромцевим.

1. Фіксація свіжих, вологих препаратів у етиловому або метил-

овому спирті 1 – 2 год за кімнатної температури або 15 – 20 хв при

+50…+70

С; промивання дистильованою водою.

2. Синька Мансона 1 : 40 (2 г бури розчиняють у 25 см

бідисти-

льованої води при кип’ятінні, додають у гарячий розчин 0,5 г мети-

ленової синьки і доводять бідистильованою водою до 1 дм

) — 5 – 10 хв.

3. 5 – 10%-й розчин таніну — 5 – 10 хв до появи блакитного від-

тінку; промивання дистильованою водою, висушування фільтрува-

льним папером.

4. Абсолютний спирт або суміш абсолютного спирту з ацетоном

(1 : 1) — кілька секунд; висушування на повітрі.

Препарати розглядають у світловому мікроскопі під імерсійною

олією. Фон і цитоплазма нервових клітин блідо-блакитна, ядра сині,

Лабораторна діагностика вірусних хвороб

ядерця темно-сині, еритроцити оранжево-червоні, а тільця Бабе-

ша – Негрі різко окреслені, фіолетового кольору з рожевим відтін-

ком і темно-синьою зернистістю.

Фарбування за Селлером.

На свіжі, вологі препарати наносять на 10 – 30 с фарбу, яка склада-

ється із суміші 1%-х розчинів основного фуксину (1 частина) і метиле-

нової синьки (2 частини); промивають ФБР, висушують на повітрі.

Нервові клітини (цитоплазма, ядра та ядерця) зафарбовуються в

синій колір, інтерстиціальна тканина рожева, еритроцити цегляно-

червоні, а тільця Бабеша – Негрі пурпурово-червоного кольору з

темно-синьою зернистістю.

МОЛЕКУЛЯРНА ГІБРИДИЗАЦІЯ НУКЛЕЇНОВИХ КИСЛОТ

Перспективним методом у лабораторній діагностиці вірусних ін-

фекцій є молекулярна гібридизація (МГ) нуклеїнових кислот, яку

використовують із метою виявлення вірусних ДНК- і РНК-геномів

безпосередньо в патологічному матеріалі. Цей метод незамінний для

ідентифікації вірусів, що не культивуються в лабораторних умовах, а

також персистувальних вірусів і провірусів (інтегровані вірусоспеци-

фічні нуклеотидні послідовності в складі клітинних геномів).

Що таке гібридизація? Наприклад, молекулу двонитчастої ДНК

денатурують на два окремі нуклеотидні ланцюги під дією темпера-

тури +80…+100 ºС або лугу, а потім у разі тривалої експозиції при

+55…+65 ºС одноланцюгові ДНК взаємодіють і утворюють двонит-

часту молекулу, ідентичну вихідній. Такий процес називається гіб-

ридизацією. Реакція гібридизації може відбутися між будь-якими

двома одноланцюговими нуклеїновими кислотами — ДНК – ДНК,

ДНК – РНК, РНК – РНК, але за обов’язкової умови: якщо вони ма-

ють комплементарні нуклеотидні послідовності.

Одноланцюгові ДНК і РНК, за допомогою яких у дослідному ма-

теріалі виявляють комплементарні нитки, називають зондом. Для

його одержання можна використовувати нуклеїнову кислоту, виді-

лену з віріонів, або іРНК, отриману шляхом транскрипції in vitro.

Проте найдешевшим зондом є клонована рекомбінантна ДНК —

ДНК-зонд. Його виготовляють на основі плазмідного вектора, в

який вбудовують висококонсервативний фрагмент вірусної ДНК або

ДНК-копію потрібного фрагмента вірусної РНК, що одержують

шляхом зворотної транскрипції. Рекомбінантну ДНК мітять відпо-

відним методом (радіоактивним фосфором або біотином) і денату-

рують при +80…+100 ºС. У результаті отримують дві одноланцюгові

молекули ДНК із вірусоспецифічними нуклеотидними послідовнос-

тями, які є ДНК-зондами.

Для мічення зонда використовують радіоактивні попередники,

зазвичай радіоактивний фосфор (Р

). Реакцію мічення зонда нази-

Розділ 11

вають нік-трансляцією. Вона основана на розривах нитки ДНК ен-

донуклеазою й одночасному ковалентному приєднанні до кінців

розривів за допомогою кінцевої трансферази нуклеотидів, мічених

. Недоліком цього методу є короткий період напіврозпаду Р

необхідність мати спеціальне устаткування для виявлення радіоак-

тивності. Тому перспективнішим є застосування колориметричних

реакцій. Для цього в молекулу зонда під час нік-трансляції вводять

біотин, який може міцно зв’язувати авідин або стрептовіридин, що у

свою чергу з’єднані з ферментом (пероксидазою або лужною фосфа-

тазою). Якщо додати до такого зонда відповідний субстрат, під дією

ферменту субстрат розкладається, утворюючи кольоровий продукт

реакції, видимий візуально.

Швидкість гібридизації залежить від багатьох умов, найважли-

вішими з яких є температура реакції та йонна сила розчину. Тем-

пература, за якої половина молекул нуклеїнової кислоти перебуває

у дволанцюговій формі, називається температурою плавлення. Реак-

ція гібридизації має широкий температурний оптимум — від +30 до

+65 ºС, що нижче за температуру плавлення. Реакція відбувається

найкраще при 0,4М Na

; при 0,15М Na

швидкість гібридизації

знижується майже в 7 разів. На швидкість реакції впливають також

в’язкість і рН розчину, кількість пар основ ДНК у дуплексі тощо.

Від цих самих умов залежить утворення стабільних гібридів і, отже,

специфічність реакції.

Методика індикації вірусних нуклеїнових кислот у пато-

логічному матеріалі об’єднує такі етапи:

1) одержання і мічення зонда (Р

або біотином);

2) виділення з патологічного матеріалу нуклеїнових кислот та

їхня денатурація (центрифугат суспензії з дослідного матеріалу об-

робляють спочатку протеїназою К, потім фенолом із хлороформом,

які руйнують білки; після їхнього видалення нуклеїнові кислоти

осаджують при –70 ºС, осад відмивають спиртом і піддають денату-

рації кип’ятінням або обробкою лугом);

3) контакт одноланцюгових нуклеїнових кислот із зондом при

+55…+65 ºС упродовж близько 2 год, що призводить до утворення

дволанцюгових молекул у разі їхньої комплементарності (молеку-

лярна гібридизація);

4) видалення всіх негібридизованих молекул нуклеїнових кислот

(обробкою натрію додецилсульфатом і натрію цитратом);

5) індикація утворених дволанцюгових молекул нуклеїнових кис-

лот за міткою зонда (Р

виявляють методом авторадіографії або

підрахунком імпульсів у гамма-лічильнику, а наявність біотину

встановлюють колориметричним методом).

Існує кілька варіантів методу молекулярної гібридизації.

Гібридизація на фільтрі. Найзручнішим і найпростішим ме-

тодом є гібридизація нуклеїнових кислот не в розчині, а іммобілізо-

Лабораторна діагностика вірусних хвороб

ваних на твердому носії — нітроцелюлозному фільтрі. Для цього на

фільтр наносять дослідну нуклеїнову кислоту (в одноланцюговій

формі), додають мічений зонд. У разі комплементарності двох моле-

кул нуклеїнових кислот утворюються гібриди, прикріплені до носія,

де і проводять їхню ідентифікацію.

Точкова гібридизація дає змогу одночасно дослідити багато

проб, наносячи на нітроцелюлозні фільтри виділені з патологічного

матеріалу нуклеїнові кислоти, а потім мічений зонд.

Блот-гібридизація (або блотинг за Саузерном). Дослідну

ДНК нарізують рестрикційними ендонуклеазами на фрагменти, які

розділяють електрофорезом в агарозі або поліакриламідному гелі.

Потім фрагменти переносять на нітроцелюлозні фільтри і додають

мічений зонд. Метод застосовують для виявлення в пухлинній тка-

нині інтегрованих вірусних геномів і для визначення кількості про-

вірусів у клітинних ДНК. Аналогічний метод можна використовува-

ти і для виявлення фрагментів РНК.

Сандвіч-гібридизація ґрунтується на використанні двох клоно-

ваних фрагментів ДНК, один з яких іммобілізований на нітроцелю-

лозному фільтрі, а другий є міченим зондом. Наявна в дослідній

пробі комплементарна нитка нуклеїнової кислоти гібридизується з

обома нитками ДНК і зв’язує зонд із фільтром. Можливий інший

варіант методу: зонд гібридизується з відомою ДНК, іммобілізова-

ною на фільтрі, та зв’язує комплементарну ДНК, що знаходиться в

пробі.

Гібридизацію in situ застосовують при дослідженні замороже-

них зрізів тканин із метою індикації вірусних нуклеїнових кислот в

окремих клітинах. Метод використовують для вивчення

персистувальних і онкогенних вірусів.

Молекулярна гібридизація є високочутливою реакцією, яка дає

змогу встановити в дослідному матеріалі нуклеїнові кислоти в ни-

зьких концентраціях (1 – 10 пг

). Проте чутливість методу часто не-

достатня для виявлення провірусів, якщо заражено небагато клітин

в організмі. У такому разі проводять ампліфікацію вірусних нуклеї-

нових кислот шляхом додавання РНК-затравки, комплементарної

певним ділянкам обох ниток ДНК у консервативній частині моле-

кули, і потім ідентифікують ДНК за допомогою міченого зонда.

Метод молекулярної гібридизації нуклеїнових кислот застосовують

з діагностичною метою нечасто, оскільки для нього потрібні спеціальні

реактиви та обладнання. Проте розвиток технології виробництва ре-

комбінантних ДНК і хімічного синтезу нуклеїнових кислот дає змогу

одержувати зонди будь-якої специфічності, що сприятиме широкому

впровадженню цього методу у вірусологічну практику.

Один пікограм (пг) становить 10

–12

г.

Розділ 11

ПОЛІМЕРАЗНА ЛАНЦЮГОВА РЕАКЦІЯ (ПЛР)

В основу ПЛР покладено блискучі досягнення молекулярної біо-

логії: відкриття ферменту ДНК-полімерази, розробка методу секве-

нування молекули ДНК, а також синтез олігонуклеотидів різної до-

вжини і специфічности (праймерів). Суть ПЛР (або методу амплі-

фікації генів) полягає в збільшенні in vitro генетичного матеріалу

вірусу, який треба ідентифікувати в дослідному матеріалі. При

цьому ампліфікуються головним чином конкретні (здебільшого кон-

сервативні) фрагменти вірусного геному.

Ділянку ДНК, яку потрібно копіювати, називають ампліфіко-

ном. Його межі визначаються, як правило, двома олігонуклеотид-

ними праймерами. Це відрізки одноланцюгової ДНК завдовжки

20 – 30 нуклеотидів, які комплементарні певним послідовностям

кожної з ниток ДНК-матриці та слугують затравкою для синтезу

нового ланцюга ДНК. При синтезі ДНК праймери фізично вбудо-

вуються у фрагменти ДНК-матриці, що ампліфікується.

Праймери добудовує до заданого розміру термостабільний фер-

мент Taq-ДНК-полімераза, яка одержана з термофільної бактерії

Thermophylus aquaticus. Taq-ДНК-полімераза витримує багаторазове

нагрівання до +90 ºС, що дало змогу проводити реакції в автоматич-

ному режимі — ампліфікаторі. Taq-ДНК-полімераза синтезує лан-

цюг ДНК розміром до 1000 пар нуклеотидів за 1 хв. Можливості ПЛР

в ідентифікації вірусів ще більше зросли у зв’язку з виділенням із

термофільної бактерії Thermus thermophylus ферменту, що виявляє

активність як ДНК-полімерази, так і зворотної транскриптази. За

допомогою цього ферменту спрощується виявлення у ПЛР РНК-

вмісних вірусів. Taq-ДНК-полімераза продовжує олігонуклеотидні

праймери, додаючи до їхнього 3′-кінця наступний додатковий нукле-

отид. Але для цього потрібен праймер, гібридизований із комплемен-

тарним ланцюгом ДНК-матриці. Її пошук і є завданням ПЛР.

Реакційна суміш, де відбувається ПЛР, має містити в достатній кі-

лькості нуклеотиди («будівельні блоки»), специфічні олігонуклеотидні

праймери і дослідний матеріал у вигляді ізольованої з нього ДНК або

ДНК-копії РНК-геному, яку отримують зворотною транскрипцією.

ПЛР складається з трьох процесів, які циклічно повторюються:

1) денатурація дослідної дволанцюгової ДНК нагріванням реак-

ційної суміші до +90…+100 ºС;

2) відпалювання праймерів (гібридизація праймерів із компле-

ментарними ділянками одноланцюгової ДНК при +55…+65 ºС);

3) елонгація (добудова) праймерів до заданого розміру вірусного

геному під дією Taq-ДНК-полімерази при +72 ºС.

Весь цикл ампліфікації триває всього 5 – 10 хв і може повторю-

ватися до 20 – 40 разів. За кожний цикл відбувається подвоєння кі-

лькості молекул ДНК у пробі. Кожен із новосинтезованих ланцюгів

Лабораторна діагностика вірусних хвороб

ДНК слугує матрицею для синтезу молекул ДНК, які за довжиною

й нуклеотидними послідовностями ідентичні ділянці ДНК, вибра-

ній для ампліфікації. Праймери орієнтовані так, щоб синтез за до-

помогою Taq-ДНК-полімерази відбувався тільки між ними, подвою-

ючи кількість копій заданої ділянки ДНК. Оптимальна відстань

між праймерами (довжина ділянки ампліфікації) становить 200 –

500 пар нуклеотидів. Практично вдається ампліфікувати фрагмен-

ти ДНК завдовжки до 3 – 4 тис. пар нуклеотидів, хоча можна досяг-

ти і 10 тис. пар нуклеотидів. За 40 циклів ампліфікації кількість

копій ДНК зростає в 10

разів. Таку кількість вірусної ДНК тепер

можна ідентифікувати будь-яким методом: електрофорез в агарозі

або поліакриламідному гелі з фарбуванням бромистим етидієм, гіб-

ридизація з міченими зондами, безпосереднє колориметричне, флу-

орометричне чи радіоізотопне визначення при використанні в сис-

темі ПЛР мічених попередників синтезу нуклеїнових кислот.

Збільшення кількості вірусної ДНК у 10

разів цілком достатньо

для виявлення її методом молекулярної гібридизації без поперед-

нього нагромадження вірусу в культурі клітин. Слід зазначити, що

довгі необмежені копії ДНК можуть синтезуватися тільки з вихід-

них батьківських ланцюгів ДНК, і за 40 циклів ПЛР може утвори-

тися тільки 40 таких копій кожного з батьківських ланцюгів, що

дуже мало порівняно з кількістю основного продукту.

Нині ПЛР у поєднанні з методом молекулярної гібридизації успіш-

но використовують для діагностики ВІЛ-інфекції, гепатиту В, папі-

ломавірусних інфекцій людини, хвороби Ауєскі, чуми ВРХ, вірусної

діареї ВРХ, інфекційного ринотрахеїту ВРХ, класичної та африкан-

ської чуми свиней, алеутської хвороби норок, хвороби Марека та ін.

ПЛР незамінна при ідентифікації вірусів, для яких ще не знайдені

чутливі культури клітин або не розроблені серологічні тести, а також

при дослідженні проб із навколишнього середовища, що сильно кон-

таміновані мікроорганізмами і непридатні для зараження культури

клітин. Методом ПЛР можна не тільки ампліфікувати потрібну ДНК,

а й вносити в неї при цьому необхідні зміни, що відкриває необмеже-

ні можливості для молекулярної біології та генної інженерії.

ВИДІЛЕННЯ ВІРУСІВ НА ЧУТЛИВИХ

БІОЛОГІЧНИХ ОБ’ЄКТАХ

ВИДІЛЕННЯ ВІРУСІВ НА ЛАБОРАТОРНИХ ТВАРИНАХ

Однією з поширених моделей для виділення вірусів із патологіч-

ного матеріалу є лабораторні тварини. Найчастіше у вірусологічній

практиці використовують білих мишей, кролів, білих щурів і морсь-

ких свинок, рідше — золотистих хом’яків і тхорів. Іноді як лаборатор-

ні об’єкти використовуються кури, голуби, кошенята, щенята. І дуже

Розділ 11

рідко ставлять біопробу на природно сприйнятливих тваринах (на-

приклад, при ящурі, інфекційній анемії коней, класичній і афри-

канській чумі свиней), що пов’язано з потенційною небезпекою по-

ширення інфекції та економічними витратами.

Основні вимоги, які ставляться до лабораторних тварин: 1) ма-

ють бути абсолютно здоровими; 2) мають бути чутливими до цього

вірусу (відповідного виду і віку); 3) повинні мати стандартну чутли-

вість до вірусу.

Тварин, які надходять до віварію вірусологічної лабораторії, ви-

тримують у карантині 2 – 3 тижні. У разі встановлення інфекційно-

го захворювання всю партію тварин знищують. Треба мати на увазі,

що в лабораторних тварин трапляються латентні інфекції. На-

приклад, серед мишей може персистувати вірус ектромелії, який

спричинює некротичне запалення лап, а при генералізації інфек-

ції — осередки некрозу в печінці й селезінці. Пневмонії в мишей

спричинюють близько 10 вірусів, найчастіше вірус Сендай. Віруси

лімфоцитарного хоріоменінгіту й енцефаломієліту мишей спричи-

нюють нейроінфекції, які виявляються судомами, парезами і пара-

лічами. Серед мишей можуть персистувати онкогенні віруси поліо-

ми, лейкозу, пухлини молочних залоз. У щурів часто виділяється

латентний вірус Кілхема, який спричинює в хом’яків летальну ін-

фекцію з масовими крововиливами в кишках. У щурів також вияв-

ляють цитомегаловірус, який спричинює аборти.

Постановка біопроби на тваринах-вірусоносіях може призвести до

активізації латентного збудника і діагностичної помилки в кінцевому

результаті. Наявність безсимптомної вірусної інфекції може проявля-

тися зниженням (аж до повного зникнення) чутливості тварин до до-

слідного вірусу внаслідок явища інтерференції. Цих труднощів уда-

ється уникнути, якщо періодично проводити контроль. Для виявлен-

ня латентних інфекцій убивають кількох тварин, із певних органів

виготовляють суспензії та заражають відповідними методами тварин

цієї самої групи (наприклад, суспензію з мозку вводять інтрацереб-

рально). За наявності безсимптомного вірусоносійства зараження

призводить до загострення інфекційного процесу. Крім того, для ви-

явлення латентної інфекції тварин обробляють відповідними препа-

ратами, зокрема кортизоном, який пригнічує імунну систему. Ступінь

чутливості тварин до вірусів можна встановити, якщо заражати їх

заздалегідь відомим вірусовмісним матеріалом.

Для культивування вірусів використовують лабораторних тва-

рин того виду, який є чутливим до цього збудника. Наприклад, ві-

руси грипу людини і свиней добре репродукуються в організмі тхо-

рів, хом’яків та щурів, а кролі й морські свинки несприйнятливі до

них. Вік тварини також має істотне значення при постановці біо-

проби. Більшість вірусів краще розмножується в організмі молодих і

навіть новонароджених тварин. Так, до вірусу ящуру чутливі ново-

Лабораторна діагностика вірусних хвороб

народжені мишенята і кроленята, тоді як дорослі тварини абсолют-

но резистентні. Біопроба при діагностиці сказу, інфекційної ката-

ральної гарячки овець, ринопневмонії коней, африканської чуми

коней, кліщового енцефаліту ставиться на мишенятах-сисунах. Он-

когенність деяких вірусів (наприклад, аденовірусу ВРХ) вивчають

на новонароджених золотистих хом’ячках. При діагностиці вірусних

хвороб птиці (грипу, віспи, ньюкаслської хвороби, інфекційного брон-

хіту, інфекційного ларинготрахеїту, хвороби Марека) ставлять біо-

пробу на курчатах. Разом з тим, в окремих випадках для відтворен-

ня специфічних клінічних ознак хвороби використовують дорослих

тварин, наприклад, кролів при діагностиці хвороби Ауєскі або мор-

ських свинок при діагностиці ящуру.

Стандартна чутливість до вірусу досягається добором тварин за

принципом аналогів (одного віку, статі, маси). Однією пробою дослід-

ного матеріалу заражають не менше чотирьох тварин. У науково-

дослідній роботі використовують тварин інбредних ліній, одержані

внаслідок близькородинного спаровування (впродовж не менш як 20

поколінь), які практично однаково реагують на той чи інший вірус.

Для деяких вірусологічних досліджень (наприклад, при виділенні

вірусу з нез’ясованими патогенними властивостями) потрібно засто-

совувати гнотобіотів. Термін «гнотобіоти» об’єднує дві категорії тва-

рин: 1) стерильні (безмікробні) тварини, які не мають жодних мікро-

бів; 2) гнотофори, що містять один або кілька видів мікроорганізмів,

відомих досліднику. Тварин-гнотобіотів одержують шляхом кесарева

розтину або ампутації матки, стерильну птицю — інкубацією яєць зі

стерильною шкаралупою в стерильному інкубаторі. Тварин утриму-

ють у стерильних ізоляторах: повітря, вода, корми мають бути сте-

рильними. Нині одержані гнотобіоти в мишей, щурів, кролів, мор-

ських свинок, свиней, овець, кіз, мавп, собак, котів, курей. Гнотобіоти

чутливіші до вірусної інфекції. Крім того, їхнє застосування повністю

виключає вплив латентних збудників, які можуть персистувати в ор-

ганізмі лабораторних тварин. На жаль, одержання і вирощування

гнотобіотів пов’язано з великими економічними витратами, що стри-

мує їхнє впровадження в широку вірусологічну практику.

Методи експериментального зараження лабораторних

тварин. Існують різні способи введення інфекційного матеріалу

лабораторним тваринам, що визначається тропізмом вірусу. У віру-

сологічній практиці найчастіше використовують такі методи зара-

ження: підшкірний, внутрішньошкірний, у скарифіковану шкіру,

внутрішньом’язовий, внутрішньочеревинний, внутрішньовенний,

інтраназальний, інтрацеребральний. Рідко застосовують інші мето-

ди: субокципітальний (підпотиличний), інтраспінальний (у спин-

ний мозок), у периферійний нервовий стовбур (сідничного або пле-

чового нервів), інтракардіальний, інтратестикулярний, в око (на

рогівку, в рогівку, в передню камеру), в кон’юнктиву, через травний

Розділ 11

канал (орально, в шлунок, ректально). Нижче описано найпошире-

ніші методи зараження лабораторних тварин.

Підшкірне зараження. Місце ін’єкції — в ділянці спини, черева

або бокової поверхні. Після видалення шерсті й дезінфекції спирто-

вим розчином йоду захоплюють складку шкіри, і в її основу парале-

льно до поверхні тіла вводять голку. Максимальна доза для зара-

ження: миші — 0,5 см

, щури і морські свинки — 3, кролі — 5 см

Внутрішньошкірне зараження. У кролів і морських свинок на

боці, череві або спині вистригають і виголюють шерсть, дезінфіку-

ють. Тонку голку скосом назовні вводять паралельно до поверхні

шкіри так, щоб голка просвічувалася крізь епідерміс. Матеріал вво-

дять до припіднімання шару шкіри у вигляді бугорка. Дрібним тва-

ринам внутрішньошкірне зараження проводять у плантарну поверх-

ню задньої кінцівки, вводячи голку в шкіру в напрямку від пальців

до заплеснового суглоба. Максимальна доза для зараження: ми-

ші — 0,02 см

, щури — 0,05, морські свинки і кролі — 0,1 см

Зараження в скарифіковану шкіру. У ділянці боку, черева або

спини вистригають і виголюють шерсть, дезінфікують. Роблять кі-

лька поверхневих подряпин голкою або пастерівською піпеткою (до

появи крапель лімфи), наносять матеріал, який втирають шпателем

або скляною паличкою.

Внутрішньом’язове зараження. Після видалення шерсті й дез-

інфекції голку вводять у м’язи стегна, спрямовуючи її перпендику-

лярно до поверхні тіла. Максимальні дози для зараження: миші —

0,3 см

, щури — 1, морські свинки — 2, кролі — 5 см

Внутрішньочеревинне (інтраперитонеальне) зараження. Тва-

рину фіксують вертикально вниз головою для того, щоб органи че-

ревної порожнини змістилися до діафрагми і не травмувати кишки

при інокуляції матеріалу. Відтягують задню кінцівку, дезінфікують

ділянку паху, куди вводять голку під кутом 45° до поздовжньої осі

тіла на глибину 0,3 – 0,5 см. Максимальна доза для зараження:

миші — 1 см

, щури — 2, морські свинки — 5, кролі — 10.

Внутрішньовенне зараження. Кролів заражають у крайову вену

вуха. На місці ін’єкції вистригають шерсть, дезінфікують шкіру, ву-

хо масажують або натирають ксилолом і перетискають біля основи

для набухання вени. Голку вводять у судину в напрямку до голови

приблизно на 1 см, при цьому перестають перетискати вухо. Білих

мишей і щурів заражають у бокові вени хвоста, для розширення

яких хвіст розтирають ксилолом або витримують у теплій воді

(+50…+55 °С). Хвіст перетискають біля основи, вводять голку скосом

назовні у вену нижньої третини хвоста, де шкіра тонша, в напрямку

до тулуба. Якщо голка потрапила в судину, то рідина легко надхо-

дить зі шприца, а судина на всьому проміжку біліє. Для внутріш-

ньовенного зараження морської свинки потрібне хірургічне препа-

рування яремної вени. Максимальна доза для зараження: миші —

1 см

, щури і морські свинки — 2, кролі — 5 см