Рубин А.Б. Современные методы биофизических исследований (Практикум по биофизике)

Подождите немного. Документ загружается.

сти поляризации при зондировании, попадал на образец. Перед

образцом был установлен фотозатвор, регулирующий время зонди-

рования,

чтобы избежать стационарного изменения поглощения объ-

екта до включения возбуждающей вспышки. Время зондирования

составляло около 200 мс. Интенсивности возбуждающего и изме-

ряющего света различались в пять раз. Такое увеличение интенсив-

ности измеряющего света позволило

улучшить

разрешающую

способность установки (А/// — 10~

Чтобы преодолеть артефакты, вызванные релаксационными про-

цессами фотоумножителя, фотокатод дополнительно освещался;

время действия света также регулировалось фотозатвором. Оба фото-

затвора (для измеряющего и дополнительного света) работали в ре-

жиме попеременного перекрывания таким образом, что уровень све-

тового потока на фотокатоде оставался практически постоянным.

Чтобы избежать появления дихроизма, индуцированного рассеян-

ным

возбуждающим светом, и влияния поляризованной флуорес-

ценции,

дополнительные поляризаторы

между

образцом и фотоумно-

жителем не ставились. Регистрируемые сигналы изменений погло-

щения

индуцировались многократно, усреднялись компьютером и

записывались в виде кинетических кривых АЛ

^ f(t), АЛ

—f(t)

при

разных длинах волн измеряющего света. Затем по точкам

строился спектр дихроичного отношения ДЛц

ДЛ

f (X), по-

ляризации

(АЛ

—Д/4

_,_)/(АЛ

+ ДЛ

) /(Я.) или анизотропии

(АЛ

„

ДЛ

)/(АЛ

„

+ 2 A A J - /

(к).

Эксперименты позволили установить, что дипольные моменты

переходов каротиноидов и фотоиндуцированных изменений поглоще-

ния

пигмента реакционного центра фотосистемы I (P

) ориентиро-

ваны практически одинаковым образом (параллельно

друг

другу).

Дихроичное отношение при этом не превышало величины 4/3, что

характерно для систем с круговым вырождением переходного мо-

мента.

Измерение

кинетики и спектров фотодихроизма методом фотосе-

лекции

может быть осуществлено и с помощью однолучевого диф-

ференциального спектрофотометра с фосфороскопом (см. рис. 27).

В этом

случае

поляризация возбуждающего и измерительного света

может производиться, например, призмами Рошона и Франка —

Риттера соответственно. Такую установку использовали для изу-

чения

кинетики фотодихроизма реакционных центров фотосинтези-

рующих бактерий при 100 К. Исследовали кинетику изменений

поглощения

АА

980

при различной взаимной ориентации плоскости

поляризации

возбуждающего и измеряющего света (параллельной

или

перпендикулярной соответственно). Измеряли также и спектры

изменений

поглощения, вызванных возбуждающим светом (при

980 и 890 нм), который был поляризован параллельно и перпенди-

кулярно по отношению к измерительному

свету.

Результаты таких

исследований позволили получить информацию о характере взаимо-

действия

ориентации пигментов

реакционных центрах некоторых

фотосинтезирующих бактерий.

Метод

фотоиндуцированного линейного дихроизма.

Этот метод

для ориентированных образцов

отличие

от

фотоселекции

уже не

требует

использования поляризованного возбуждающего светового

потока. Анизотропия

этом

случае

достигается предварительной

ориентацией объекта

(при

наложении

на

него магнитного поля,

при

деформации геля

или

растяжении пленок, содержащих объект,

т.

п.).

Использование ориентированных образцов позволяет увели-

чить чувствительность метода

при

регистрации фотоиндуцирован-

ных изменений дихроизма

по

сравнению

фотоселекцией. Измене-

ния

поглощения ориентированного объекта вызываются неполяри-

зованным возбуждающим светом,

измеряющий поляризованный

свет зондирует образец

при

разных длинах волн. Направление

ори-

ентации плоскополяризованного измеряющего

луча

выбирают

па-

раллельно

перпендикулярно

оси или

плоскости ориентации

объ-

екта соответственно (например,

оси

вытягивания геля

или

плоско-

сти мембраны). Измеряют кинетику

спектры фотоиндуцированных

изменений

поглощения

при

параллельной

АА

= / (к) и

перпен-

дикулярной

АА

= f (к)

поляризации зондирующего

луча.

Данные

могут

быть представлены

виде спектральной зависимо-

сти дихроичного отношения фотоиндуцированных изменений погло-

щения

D (АА) —

ДЛц/ЛЛ

или

степени поляризации

Р (АА) ----

(АА

— АЛ

)/(ДЛ

|| + Д A

). С

помощью такого метода иссле-

довали фотодихроизм субхлоропластных частиц, пигмент-белко-

вых комплексов высших растений, хроматофоров

реакционных

центров фотосинтезирующих бактерий. Получены

результаты

об

ориентации дипольных моментов переходов фотоактивных компо-

нентов этих объектов

высказаны предположения

возможном

расположении макромолекулярных комплексов

нативных фото-

синтетических мембранах.

Для

изучения фотодихроизма ориентиро-

ванных образцов может быть использован однолучевой дифферен-

циальный спектрофотометр

фосфороскопом

(см. рис. 27).

После

монохроматора измеряющий

луч

проходит через подвижный поля-

роид,

при

вращении которого изменяется ориентация плоскости

поляризации

зондирующего светового потока.

Существует

вариант

однолучевого дифференциального спектрофотометра

чувствитель-

ностью порядка

10~

единиц оптической плотности,

котором

воз-

буждающий

измеряющий

лучи

коммутируются дисковым фосфо-

роскопом.

Метод фотоиндуцированных изменений дихроизма нашел приме-

нение

при

изучении вращательной

латеральной диффузии мембран-

ных белков. Оптические методы,

прежде всего поляризационная

флуорометрия, основные особенности

способы регистрации кото-

рой были изложены ранее,

принципе давно применяются

для

исследования вращательных движений макромолекул

водных

растворах. Метод измерения поляризованной флуоресценции исполь-

зовался достаточно успешно, поскольку время жизни флуорес-

ценции

(~ 10~

с) несильно отличается в этих

случаях

от измеряе-

мых времен вращательной релаксации. Однако, когда вращатель-

ная

релаксация молекулы происходит в течение более длительного

времени

(т> Ю-

с), флуоресцентный метод не работает, поскольку

излучение

затухает

раньше, чем может осуществиться поворот

молекулы.

В частности, показано, что вращение молекулы родопсина в на-

ружном мембранном сегменте при 20 °С происходит за 20 мкс. Если

предположить, что вязкость мембраны по крайней мере в 100 раз

больше вязкости водной среды, можно рассчитать, что времена ре-

лаксации

внутренних глобулярных мембранных белков составля-

ют микросекунды и более. Для того чтобы измерить такие относи-

тельно медленные движения с помощью оптической спектроскопии,

необходимо, чтобы времена жизни возбужденного состояния моле-

кулы или образующихся фотопродуктов были достаточно длитель-

ными.

Эти соображения позволили предложить в качестве основного

метода измерения вращательных движений мембранных белков

метод

триплетных

зондов,

обладающих относительно большим

временем жизни. Триплетные зонды использованы также и для

изучения подвижности макромолекулярных комплексов в водных

растворах. Наиболее частно применяют в качестве триплетных зон-

дов производные эозина, которые ковалентно связываются с моле-

кулами белка.

Спектроскопический

метод измерения вращательной подвижно-

сти основывается на

фотоселекции,

когда поляризованный действую-

щий

свет создает популяцию возбужденных молекул с определен-

ной

ориентацией в исходно изотропной системе. Сигналы, возни-

кающие от таких возбужденных молекул, в основном отражают их

анизотропное

распределение, что выражается в дихроизме регистри-

руемых

абсорбционных изменений. Если возбуждение производится

коротким

импульсом света, начальная абсорбционная анизотропия

со временем уменьшается (затухает), поскольку молекулы

вследст-

вие броуновских движений распределяются хаотически. Измерение

скорости

затухания

анизотропии

позволяет определить время

вращательной релаксации молекулы. Кинетические измерения

фотодихроизма

производятся в соответствии с общим принципом

фотоселекции,

когда возбуждение осуществляется вспышкой верти-

кально

поляризованного света, а измеряющий свет, поляризован-

ный

параллельно и перпендикулярно

возбуждающему

лучу,

зон-

дирует

образец. В современных приборах измеряющий луч с по-

мощью специальной системы расщепляется на вертикально и гори-

зонтально поляризованные составляющие, что позволяет одновре-

менно

регистрировать абсорбционные изменения для

двух

компонен-

тов: АЛ л и АЛ

. Такие приборы имеют временное разрешение

около

нескольких микросекунд.

Рис.

'М. Модель, используемая для

интерпретации вращательных дви-

жений белка (Б) в мембране (М), из-

меряемых с помощью фотоиндуциро-

ванного дихроизма:

угол

между нормалью (п) к плоско-

мембраны и вектором абсорбционно-

()

сти

I Полученные данные анализи-

руют,

рассчитывая анизотропию

поглощения г (t) -•= (АЛ ц(^) —

-AA

(t)/(AA

(0 + 2 АЛ

,(/)),

где АЛ л (t) и АЛ

(t) — величи-

ны

изменений поглощения за

время t после вспышки для па-

раллельной и перпендикулярной

составляющих по отношению к

поляризации

возбуждающего

импульса. Величина г (t) не за-

висит от времени жизни сигнала,

а только от вращательных дви-

жений,

когда абсорбционные из-

менения

затухают

экспонен-

циально.

Можно установить

связь

между

г (t) и коэффициен-

том вращательной диффузии

(DR).

ДЛЯ специального случая

изотропного вращения г (t)

---

т'

ехр (—6 D

t), где г'

константа, которая зависит от

угла

между

дипольными моментами

переходов, использованных для возбуждения и измерения, а также

от инструментальных факторов.

случае

мембранных белков необходимо учитывать анизотро-

пию структуры мембраны, которая фактически должна определять

их анизотропное вращение. На рис. 33 показана возможная модель,

используемая для анализа экспериментальных данных; в соответ-

ствии с ней вращательные движения белка

могут

быть охарактери-

зованы двумя диффузионными коэффициентами: D

—для враще-

ния

вокруг нормали к плоскости мембраны \\ D

—для вращения

вокруг осей лежащих в плоскости мембраны.

Для такой модели

(*)=

2И, ехр (-£,/). где

Л, = (6/5) sin

ф cos

ф; Л

(3/10)

sin

q>;

.4„ = (1.10)(3со8«ф—О

; Ei = 5D

р р р

го дипольного момента перехода (Д)

В том случае, если дипольные моменты переходов, которые исполь-

зуют

для возбуждения и регистрации, параллельны и исходя из

того, что большинство интегральных белков сохраняет постоянную

ориентацию, пронизывая мембрану (трансмембранные белки), по-

следнее выражение можно упростить, полагая, что D

та 0:

г (t) = А

ехр (— D, t) + Л

ехр (-4D

t) + А

Тогда т (t)

затухает,

достигая в пределе величины А

. Это не

зависящее от времени значение г (/) = А

называется

остаточной

анизотропией.

В принципе диффузионный коэффициент Оц свя-

зан

с размером белка и вязкостью мембраны. Если аппроксимиро-

вать белок цилиндром с осью симметрии, перпендикулярной плос-

кости мембраны, то Оц ~ kTI{4na*hr\), где а—

радиус

цилиндра,

h — длина части цилиндра, погруженной в мембрану, г\ — вязкость

мембраны.

В этом рассуждении считали, что

угол

ср вполне определенен. Та-

кие

ситуации характерны, например, для хромофора ретиналя бак-

териородопсина. Однако эозиновая метка, связанная с белком, об-

ладает

независимыми движениями. Эти движения достаточно быстры

ограниченны, что приводит к уменьшению измеряемого значения

г {t) по сравнению с ожидаемым, поскольку анизотропия частично

теряется в течение более короткого временного интервала, не раз-

решаемого установкой. Кроме того, к уменьшению измеряемой

анизотропии приводят также инструментальные (аппаратурные)

эффекты.

В первом приближении эти факты

требуют

внесения по-

правок

в основное уравнение:

г (t) --.

[/-„/(Л,

+ А

f А

[

А, ехр (— D

t) +

где г

— экспериментальная абсорбционная анизотропия при t 0.

Следует

учитывать также, что зонд вряд ли локализуется толь-

ко

на одном

участке

данного белка. Так как зонд в различных

местах

белка, видимо, должен быть ориентирован по-разному, то г (/)

будет

различной для каждого места локализации метки вследствие

зависимости коэффициентов А

, А

от

угла

ср. Однако пр« усло-

вии,

что время жизни абсорбционного

перехода

одинаково для каж-

дого

места локализации, наблюдаемое значение г (t) для

всех

таких

Л'

мест просто усредняется: г (t) (I,N) v

. (t), где r

(/) - вре-

/=i

менная

зависимость анизотропии поглощения для /'-го места.

В более сложных

случаях,

когда метка на различных

участках

белка имеет различное время жизни триплетных состояний, r (t)

уже не является более функцией только вращательных движений.

В этом

случае

3,ехр(-//т,-)г,(0

S,exp(-/T,)

где т

;

— время жизни, S

;

— весовой фактор для i-ro участка. Вели-

чина г (t)

будет

различаться для каждого участка и также зависеть

от времени жизни.

Метод

фотоиндуцированных спектров кругового дихроизма

можно использовать

для

изучения конформационных переходов

структурных особенностей фотоактивных компонентов биоло-

гических систем.

В институте биохимии

им. А. Н.

Баха

АН

СССР

В.В.

Шубиным

Н. В.

Карапетяном этот метод

был

разработан применительно

исследованию структурной организации первичного донора элек-

тронов фотосистемы

высших растений

(Я

700

Суть метода заклю-

чается

в том, что

регистрируют разницу

между

спектрами кругово-

го дихроизма

(КД)

образца

темноте

и на

свету

(при освещении

дей-

ствующим светом

от

независимого источника). Дифференциальный

спектр

КД

(«темнота минус

свет»)

представляет собой, таким обра-

зом,

зависимость фотоиндуцированных изменений разностных

ди-

хроичных поглощений ЛЛ

от

длины волны измеряющего

света:

АЛ

= (A

— A

)

— (A

— A

)

= f (к), где A

—

поглощение света левой

правой круговой поляризации.

Если использовать разностные дихроичные коэффициенты

экс-

тинкции,

то

Ае

-- (E

— е

)

—

(F,

— е

)

—- /

(К). Величи-

ну

— e

)

можно определить

из

соотношения

— s

) =

—

)/(cd),

где с —

концентрация, моль/л;

d —

толщина

кюветы,

см. Для

расчета

сил

вращения

можно воспользоваться

формулой Моффита

Московица, пренебрегая фактором Лоренца:

22,9-10-

dv.

Для измерения спектров фотоиндуцированных

КД

авторы

скон-

струировали фосфороскопическую приставку

стандартному дихро-

графу

(JASCO-40AS).

Образец

кювете помещали

фосфороскоп

освещали действующим светом интенсивностью

3-10~

Вт/см

от лампы накаливания

помощью

двух

световодов

под

углом

90°

измеряющему

свету,

попадающему

на

образец

от

дихрографа.

Темновой интервал

между

действующим

измеряющим светом

варьировали

от 3 до 15 мс.

Спектральная полуширина щели монохроматора дихрографа

сос-

тавляла

2 нм. Для

измерения спектров фотоиндуцированного

КД

использовали накопитель сигналов

режиме непрерывной регистра-

ции

(8 или 16

циклов накопления

темноте минус столько

же

циклов

на

свету)

и по

точкам

накоплением сигнала

при

одной длине волны

(2—3

мин

накоплений

темноте минус столько

же

накоплений

на

свету).

помощью этого метода

для

пигмент-белковых комплексов фото-

системы

удалось

показать,

что при

фотоокислении пигмента

ре-

акционного

центра наряду

основными компонентами димерного

расщепления

спектре фотоиндуцированного

КД

проявляются

ми-

норные

компоненты антенного хлорофилла.

Это

позволило выска-

зать предположение

природе комплекса реакционного центра

фотосистемы

Метод

температурного скачка при измерениях

фотоиндуцированных изменений поглощения

В институте общей физики

АН

СССР

был

разработан метод

скон-

струирована установка

для

исследования влияния теплового

им-

пульса, создаваемого излучением СО

-лазера,

на

оптические свойст-

ва биологических объектов

(в

частности, фотосинтетических мемб-

ран

пигмент-белковых комплексов). Этот метод чрезвычайно

пер-

спективен

для

прямого экспериментального определения временных

энергетических параметров конформационных переходов комплек-

сов реакционных центров, контролирующих эффективность перено-

са электронов

процессе фотосинтеза. Суть метода температурного

скачка заключается

в том, что

система

результате

достаточного

нагрева

течение короткого времени (теплового импульса) может

перейти

новое состояние (например, изменить свою конформа-

цию).

Функциональные свойства этого состояния можно тестировать,

исследуя кинетику фотоиндуцированных изменений поглощения.

Таким

образом, предложенный метод фактически объединяет

меж-

ду собой методы температурного скачка

дифференциальной абсорб-

ционной

спектрофотометрии. Этот метод позволил провести иссле-

дование температурной зависимости изменений функциональной

ак-

тивности препаратов реакционных центров фотосинтезирующих

бак-

терий

при их

импульсном разогреве. Принципиальная блок-схема

установки показана

на рис. 34.

Образец

специальной кювете

12,

помещенный

криостат

13,

подверга-

ется импульсному разогреву

за

счет поглощения

от

СО

-лазера

(средняя

мощность

10 Вт;

длина волны излучения

10,6

мкм).

Величина разогрева

ре-

гулируется

временем открытия затвора

Часть излучения (около

8 %) от-

водится

помощью плоскопараллельной пластинки

из

BaF

3 на

калори-

метр 4.Действующий свет

от

источника

8, в

качестве которого

служит

гало-

i A f

МН

Щ-

О—В—

Рис.

34.

Схема установки

для

регистрации фотоиндуцированных изменений

поглощения

при

воздействии теплового импульса (объяснение

см. в

тексте)

генная лампа мощностью

Вт,

через стеклянные фильтры

фокусирующую

линзу

10 и

затвор

попадает

на

образец, вызывая

нем

фотоиндуцирован-

ные изменения поглощения. Измеряющий

свет

от

источника

(лампа накали-

вания

мощностью

до

10 Вт)

проходит

интерференционные фильтры

фоку-

сируется

на

образец линзой

свет

проходит

через образец, стеклян-

ные фильтры

14,

диафрагму

15,

интерференционные фильтры

16 и

фокусиру-

ется линзой

17 на

фотокатод фотоумножителя /^.Сигнал

от

фотоумножителя

поступает

на

усилитель

19,

затем регистрируется осциллографом

20 и

само-

пишущим потенциометром

21.

Для снятия

температурных

зависимостей фотоиндуцированных изменений

поглощения образец

охлаждается

жидким азотом

криостате, одно

из

окон

которого, выполненное

из

BaF

, прозрачно

для

излучения СО

-лазера.

При

измерениях

на

образец посылается тепловой импульс,

затем через

определенный временной интервал (время задержки), который можно варьи-

ровать

зависимости

от

экспериментальных условий, производится световое

воздействие, индуцирующее изменение поглощения.

7. Методы динамической спектрофлуорометрии

Для исследования динамических

структурных свойств различных

биологических систем

макромолекул наряду

абсорбционными

широко

используют также

флуоресцентные методы.

При

этом

мо-

жет изучаться

как

флуоресценция самих биологических молекул

биомембран, макромолекулярных комплексов

или

целых систем

(клеток, листьев растений

и т. п.), так и флуоресцентных

меток

(или

зондов), непосредственно связанных

такими структурами

(например,

молекулой белка, мембраной

и т. п.). В

зависимости

от

конкретной

природы изучаемых явлений исследуют динамику

как

быстрой флуоресценции

(т

фл

= 10~

— 10~

с), так и

послесве-

чения

(замедленной флуоресценции

или

фосфоресценции,

10-« с).

Для исследования изменений флуоресценции,

так же как и в слу-

чае динамической абсорбционной спектроскопии, используют

диф-

ференциальные спектрофотометры. Наиболее быстрые изменения

флуоресценции изучают

помощью импульсной техники, когда

возбуждающий световой импульс генерируется лампой-вспышкой

(т

= 10~

с) или

лазером

(т = 10~

1г

-^ Ю~

с).

Основные

прин-

ципы

импульсной спектрофлуорометрии

будут

рассмотрены позже.

При

исследовании динамики относительно медленных процессов,

развивающихся

за

времена порядка миллисекунд

более

(т >

10~

с),

применяют метод фотоиндуцированных изменений

флу-

оресценции.

Метод

фотоиндуцированных изменений флуоресценции.

Факти-

чески

он

аналогичен

методу

фотоиндуцированных изменений

пог-

лощения,

регистрируемых

помощью дифференциальной спектро-

скопии.

Объект освещают интенсивным действующим светом, инду-

цирующим фотопроцесс,

более слабый

по

интенсивности измеряю-

щий

свет, возбуждающий флуоресценцию, позволяет следить

за

кинетикой

этого процесса. Метод нашел широкое применение

при

исследовании изменений флуоресценции, сопровождающих началь-

Рис.

35.

Схема модифицированного спектрофлуорометра

для

регистрации

фотоиндуцированных изменений флуоресценции (объяснение

см. в

тексте)

ные этапы процесса фотосинтеза. Выяснено, что при освещении

фотосинтезирующих объектов интенсивность флуоресценции хло-

рофилла а, прежде чем достичь стационарного уровня, изменяется,

отражая переходные процессы, связанные с состоянием реакцион-

ных центров, скоростью переноса электрона по цепи редокс-ком-

понентов,

конформационными изменениями фотосинтетических мем-

бран и т. п. Такие переходные индукционные кривые

выхода

флуо-

ресценции

обусловлены изменяющейся ее частью, т. е. так называе-

мой

переменной

флуоресценцией.

Существуют

различные типы

уста-

новок

для регистрации фотоиндуцированных изменений

выхода

флуоресценции.

В лаборатории Говинджи (США) разработан универсальный

спектрофлуорометр, позволяющий измерять спектры флуоресцен-

ции,

спектры возбуждения флуоресценции и светоиндуцированные

изменения

выхода

флуоресценции у различных фотосинтезирующих

организмов. В приборе использованы два монохроматора (на воз-

буждении и регистрации) и дополнительное освещение для инду-

цирования

изменений флуоресценции. Схема установки представле-

на

на рис. 35.

Измеряющий

свет, возбуждающий флуоресценцию,

от

источника (лампа

накаливания)

через монохроматор

светофильтр, отсекающий рассеянный

действующий свет

фотозатвор

фокусируется линзой

5 и

поворотным зерка-

лом

8 под

углом

30° на

плоское

дно

сосуда

Дьюара

содержащего кювету

образцом

(толщина слоя

1 мм).

Испускаемая образцом флуоресценция

фо-

кусируется линзой

9 и,

проходя светофильтр

10, не

пропускающий рассеянный

действующий свет, попадает

на

входную

щель регистрирующего монохрома-

тора

22. Из

выходной щели монохроматора регистрируемое излучение

(оп-

ределенной длины волны) попадает

на

фотокатод фотоумножителя

21.

Элект-

рический

сигнал затем усиливается

19 и

поступает

на

осциллограф

18 или

самопишущий потенциометр

20.

Вызывающий фотоиндуцированные изменения флуоресценции действую-

щий

свет

от

источника

(лампа накаливания

750 Вт)

через тепловой фильтр

16, фокусирующие линзы

15, 12,

светофильтр, выделяющий необходимую

об-

ласть фотовозбуждения

14, и

фотозатвор

направляется

на

кювету

с об-

разцом поворотным зеркалом

11 под

углом

30° к

плоскости

дна

сосуда

Дьюара.

Временные интервалы

для

действующего

измеряющего

лучей

регулируют-

ся

фотозатворами, срабатывающими

среднем

за 1,5—2 мс.

Разрешающая

способность установки составляет около

20 мс.

Наличие

двух

монохромато-

ров позволяет варьировать длину волны возбуждения

исследовать флуо-

ресценцию

широком спектральном диапазоне. Кроме того,

это

дает

воз-

можность использовать установку

для

измерения спектров флуоресценции

ее

возбуждения.

Существуют

другие

конструкции приборов для исследования фо-

тоиндуцированных изменений флуоресценции. Так, для регистра-

ции

индукции флуоресценции хлорофилла а фотосинтезирующих

организмов, за которую, видимо, ответственна только часть общей

флуоресценции, зависящая от эффективности фотосинтеза (т. е.

«переменная» флуоресценция), Н. В. Карапетяном и В. В. Климовым

была предложена установка с модуляцией измеряющего и действую-

щего света. Поскольку изменения выхода флуоресценции, возбуж-

даемой слабым светом, обычно исследуют при освещении объекта

действующим светом высокой интенсивности, измеряемая флуорес-

ценция

в значительной степени

будет

определяться фоновой флуо-

ресценцией,

которая возбуждается самим действующим потоком.

Чтобы исключить влияние интенсивной фоновой флуоресценции,

установке предусмотрена модуляция измерительного света с ча-

стотой, отличающейся от частоты модуляции действующего света.

Именно

на частоту модуляции измеряющего

луча

и настроена ре-

гистрирующая система. Следует

учесть

также, что интенсивная фо-

новая

флуоресценция вызывает переходные изменения чувствитель-

ности фотоумножителя, приводящие к искажению кинетики фото-

индуцированных изменений выхода флуоресценции. Для устране-

ния

таких артефактов обычно используют разделение во времени

действующего и измеряющего световых потоков. Однако при этом

измеряется только часть фотоиндуцированных изменений флуо-

ресценции

и, кроме того, действующий свет помимо флуоресценции

будет

возбуждать также и послесвечение объекта, что может

вызвать нежелательные эффекты при регистрации кинетики.

Описанная

ниже установка в значительной степени свободна от

указанных недостатков. Принцип ее устройства заключается в том,

что одновременно используются разделение измеряющего и дейст-

вующего световых лучей во времени, их модуляция с различной ча-

стотой и регистрация только модулированного сигнала от измеряю-

щего света. Установка является, по существу, модернизированным

однолучевым дифференциальным спектрофотометром. Флуоресцен-

ция

возбуждается монохроматическим светом низкой интенсивности,

а изменения ее выхода вызываются освещением объекта действую-

щим

светом, направленным под углом 90° к измеряющему. Преду-

смотрено освещение объекта при необходимости двумя действую-

щими

световыми потоками, управление которыми осуществляется

с помощью фотозатворов. На рис. 36 приведена схема такой

уста-

новки.

100