Рубин А.Б. Современные методы биофизических исследований (Практикум по биофизике)

Подождите немного. Документ загружается.

После достижения стационарного уровня фотоиндуцированных изменений

поглощения действующий свет выключают

регистрируют кинетику

вос-

становления темнового уровня поглощения.

Серию кинетических кривых можно измерить

при

различных

дойнах волн измеряющего света.

При

этом

следует

учесть,

что зна-

чение тока компенсации

)

постоянно,

интенсивность источника

(лампа накаливания)

чувствительность фотокатода являются

функцией

длины волны измеряющего света.

По

этой причине необ-

ходимо регулировать интенсивность измеряющего света шириной

щели монохроматора

или

специальной диафрагмой.

В стационарных условиях зависимость величины фотоиндуциро-

ванных изменений поглощения

от

длины волны измеряющего света

Д//7„

ж М) = /

(К)

будет

представлять собой дифференциальный

спектр

(«свет

минус темнота»), который можно построить

«по точ-

кам». Скорость переходных процессов изменения поглощения обычно

оценивают

по

времени,

течение которого

это

изменение достигает

половины своего максимального значения

качестве источ-

ника

действующего света

для

ряда специальных измерений можно

использовать лампу-вспышку (импульсный режим).

Метод

двухлучевой и двухволновой дифференциальной

абсорбционной

спектрофотометрии

§ 1 гл. I

были изложены методы разностной абсорбционной спект-

рофотометрии, основанные

на

применении

двухлучевого

метода.

Прибор

этом

случае

регистрирует разницу

между

спектром

по-

глощения контрольного

опытного образцов

стационарных усло-

виях:

AD ~ f

(К).

помощью аналогичной

двухлучевой

методики

можно следить

и за

динамикой процесса непосредственно

ходе

экс-

перимента, измеряя кинетику индуцированных внешними воздей-

ствиями изменений поглощения

при

различных длинах волн

или

соответствующие дифференциальные спектры таких изменений.

В соответствии

принципом

двухлучевой

системы модулирован-

ный

монохроматический измеряющий свет относительно небольшой

интенсивности попеременно проходит через кюветы

контрольным

опытным образцами. Кювета

опытным образцом

при

измерении

кинетики

или

спектров фотоиндуцированных изменений поглоще-

ния

освещается дополнительно интенсивным немодулированным

действующим светом

от

независимого источника.

случае

других

воздействий, приводящих, например,

хемоиндуцированным изме-

нениям

поглощения,

кювету

опытным образцом вносят соответ-

ствующие реагенты (экзогенные доноры

или

акцепторы электронов,

ингибиторы, активаторы, катионы

и т. п.), а

затем регистрируются

кинетические кривые

или

дифференциальные спектры.

Существуют

различные конструкции дифференциальных

двух-

лучевых

спектрофотометров, отличающиеся

как по

способу разде-

ления

модуляции лучей,

так и по

способу регистрации сигнала.

Наиболее оптимальными

следует

считать те методы разделения

прерывания лучей, которые обеспечивают минимальные потери

интенсивности света, постоянство по спектру разницы в интен-

сивности разделенных лучей и стабильность частоты переключения

во времени.

Достаточно перспективными можно считать комбинированные

системы, в которых делитель монохроматического

луча

света одно-

временно служит и его модулятором. Имеются спектрофотометры,

которых применяется система перекрывания лучей без темновых

интервалов за счет того, что закрывание одного

луча

в переходный

период компенсируется открыванием другого. Такая система имеет

ряд преимуществ: относительно

низкий

уровень шумов, большую

амплитуду сигнала, упрощение электронной части прибора для

авторегулирующего устройства усиления при непрерывной записи

дифференциальных спектров.

Не

останавливаясь на деталях конструкции различных дифферен-

циальных спектрофотометров, подробно изложенных в различных

Рис.

28.

Схема

дву.хлучевого

дифференциального спектрофотометра

для из-

мерения светоиндуцнрованных изменений поглощения (объяснение

см. в

тексте)

3 Ч

=Н(*=0-

•ч

Рис.

29.

Схема

двухлучевого

дифференциального спектрофотометра, собран-

ного

на

базе оптико-механической части спектрофотометра

СФ-10

(объясне-

ние

см. в

тексте)

руководствах, приведем схемы

двух

установок, сконструированных

лаборатории Л. Н.М. Дейзенса (рис. 28) и на кафедре биофизики

Биологического факультета МГУ (см. рис. 29).

Измеряющий

свет

(рис. 28) от

источника

(лампа накаливания) через

систему линз

попадает

монохроматор

Монохроматический пучок

све-

та через

выходную

щель монохроматора

фокусирующую линзу направля-

ется

на

вращающийся зеркальный диск

секторами

(делитель-модулятор),

приводимый

движение мотором

Таким образом монохроматический

луч

расщепляется

на два

модулированных

луча,

которые, проходя систему

фо-

кусирующих линз

зеркал

аттенюаторов (ослабителей светового потока)

7 и

полупрозрачное зеркало

попеременно попадают

на

контрольную

опыт-

ную кювету

образцами

Кювета

исследуемым образцом освещается

ин-

тенсивным немодулированным светом

от

независимого источника (ксеноновая

лампа)

12,

который попадает

на нее,

проходя предварительно фокусирующую

линзу

тепловой фильтр

// и

светофильтр

10.

Чтобы уменьшить влияние

рас-

сеянного

действующего света, перед фотокатодом фотоумножителя

поме-

щен

светофильтр

13.

Индуцируемое действующим светом изменение поглоще-

ния

исследуемого образца

(AD)

приводит

появлению сигнала

от

фотоумно-

жителя. Система детектирования

15 и

записи

благодаря своей конструк-

ции

чувствительна только

тому сигналу, который возникает

за

счет абсорб-

ционных

изменений.

Основным преимуществом

другого

прибора (рис. 29) является

использование системы модуляции измеряющих монохроматиче-

ских лучей без темновых интервалов, что

дает

возможность значи-

тельно улучшить параметры установки (увеличить ее чувствитель-

ность, стабильность, ввести автоматическую регулировку усиле-

ния

при непрерывной записи спектров), а также применение интег-

рирующей сферы для уменьшения влияния светорассеяния биологи-

ческого объекта на регистрируемые дифференциальные спектры.

Измеряющий

свет

от

лампы накаливания

напряжение питания кото-

рой

стабилизировано полупроводниковым стабилизатором

через конден-

сор

попадает

на

оптический клин

4, а

затем

монохроматор

Расщепле-

ние

монохроматического

луча

осуществляется

помощью поляризационных

призм

(6 —

система расщепления).

Оба

идентичных

луча

(А.,)

проходят через

модулятор

который попеременно перекрывает

их

таким образом,

что за-

крытие одного

из

лучей

переходный период сопровождается равным

ему

открытием

другого

луча.

Эти

попеременно модулированные монохроматиче-

ские

лучи

проходят через кюветы

8, 10 с

контрольным

опытным образцами,

которые разделены светонепроницаемой перегородкой

Далее через свето-

фильтр

//,

который помещен

на

входные окна, свет попадает

интегрирую-

щую сферу спектрофотометра

12,

развернутую

на 90° и

расположенную

в не-

посредственной близости

от

образцов,

затем

на

фотокатод фотоумножителя

13.

Опытный образец

кювете

освещается действующим светом

от

лампы

накаливания

22,

проходя через конденсор

21,

тепловой фильтр

20 и

сменный

светофильтр

19.

Перед кюветой

расположен механический затвор

18.

В крышке кюветного отделения укреплены иглы шприцев, через которые

можно вводить необходимые вещества

кюветы

без их

перестановки.

В дан-

ном

спектрофотометре использована следящая система, которая

регулирует

световой поток

помощью нейтрального оптического клина

на

входе

монохро-

матора

сочетании

регулировкой сетевого потока

за

счет изменения шири-

ны

входной

выходной щелей монохроматора.

Эта

система позволяет

под-

держивать выходной

ток

фотоумножителя

точностью

до

нескольких процен-

тов

при

развертке спектра

для

образцов

величиной

D < 1.

Переменная

составляющая

выхода

фотоумножителя, возникающая

из-за

разницы

поглощении контрольного

опытного образцов, усиливается

широкополосным

усилителем

14,

затем поступает

на

синхронный детектор

через балансный катодный повторитель

— на

систему коррекции нулевой

линии

17, что

необходимо

при

непрерывной записи дифференциальных спект-

ров.

Кинетические кривые

дифференциальные спектры поглощения регист-

рируются самопишущим потенциометром

16.

Средняя чувствительность тако-

го дифференциального спектрофотометра

спектральной области

от

400до

750

им

составляет около

5- 10~

единиц оптической плотности,

погрешность

измерения

не

превышает

3 %.

Для изучения кинетических абсорбционных параметров часто

применяют

двухволновые

дифференциальные спектрофотометры.

Метод двухволновой спектрофотометрии

обладает

тем преимущест-

вом, что из-за относительно небольшой разницы в величине свето-

рассеяния

для

двух

близких длин волн, проходящих через один

тот же образец, при регистрации индуцированных изменений пог-

лощения

значительно уменьшается влияние артефактов, которые

связаны

с временной зависимостью светорассеяния вследствие осе-

дания

или подвижности биологического объекта или при добавле-

нии

в кювету различных реагентов. Кроме того,

двухволновые

спект-

рофотометры удобно использовать для изучения различных про-

цессов с применением техники остановленного или ускоренного

потоков.

другой

стороны, в отличие от

двухлучевых

двухволновых

при-

борах необходимо регулировать интенсивность не общего светового

потока (до расщепления лучей), а только одного сканирующего лу-

ча,

тогда

как интенсивность

луча

сравнения (опорного) остается по-

стоянной.

Это сопряжено с определенными трудностями: ошибками

при

автоматической регулировке усиления выходного тока фото-

умножителя, особыми требованиями к регулированию интенсивности

одного из

лучей

с высокой точностью, что приводит к ограничению

возможности непрерывной записи дифференциальных спектров по

Рис.

30.

Схема двухволнового дифференциального спектрофотометра (объяс-

нение

см. в

тексте)

двухволновому

методу;

такие спектрофотометры используют глав-

ным

образом для исследования кинетики процессов.

Двухволновые спектрофотометры нашли широкое применение

при

изучении кинетических параметров редокс-превращений ком-

понентов электронного транспорта в биологических системах.

Длины волн модулированных монохроматических

лучей

А.,, А,

падающих на кювету с объектом, обычно выбирают в максимуме из-

менения

поглощения образца и в ближайшей точке с минимальным

изменением поглощения. При этом интенсивность света

лучей

подбирают за

счет

изменения щелей монохроматоров таким образом,

чтобы переменный сигнал на

выходе

приемника был равен нулю

(компенсация

переменной составляющей фототока, возникающей

из-за разницы в величинах оптической плотности D%

и D\

объекта

исходном состоянии, который не подвергался дополнительным

внешним

воздействиям).

Индуцирование абсорбционных изменений образца (действую-

щим

светом, добавлением реагентов и т. п.) вызовет появление раз-

ницы

в поглощении (AD = D\, — Dx

) и соответствующего пере-

менного сигнала, регистрируемого после усиления самопишущим

устройством (или осциллографом). Зависимость этого сигнала от

времени и представляет собой кинетическую кривую индуцирован-

ных изменений поглощения.

На

рис. 30 представлена

схема

двухволнового

абсорбционного

дифференциального спектрофотометра, предназначенного для изме-

рения

кинетики изменений поглощения различных биологических

объектов. Установка была сконструирована на кафедре биофизики

Биологического факультета МГУ.

Свет

от

источника (лампы накаливания

или

газоразрядной лампы)

2 со

стабилизатором

через фокусирующую систему попадает

делитель

3 и,

расщепляясь

на два

луча,

проецируется

на

входные щели

двух

монохромато-

ров

4, 5. Из

выходных щелей монохроматоров

два

луча

разной длины волны

, \

попадают

модулирующее устройство

6, а

затем системой зеркал

сво-

дятся

под

минимальным углом

на

кювету

образцом

которая расположена

непосредственно перед светофильтром

8 у

торца фотоумножителя

Действую-

щий

свет

от

лампы накаливания

через фокусирующую линзу

15,

тепловой

-фильтр

14,

фотозатвор

13 и

светофильтр

попадает

на

кювету

образцом.

Переменный

сигнал

фотоумножителя поступает

на

предварительный узко-

полосный усилитель

трехкаскадный усилитель переменного тока

10, а за-

тем

на

синхронный детектор

//. Для

получения опорного напряжения

ис-

пользован фотодатчик

(на

схеме

не

показан). Схема синхронного детектора

позволяет получить

на

выходе постоянное напряжение, достаточное

для

согла-

сования

записывающим устройством. Установка имеет чувствительность

около

10~

D и

благодаря конструкции кюветного отделения позволяет

про-

водить исследование биологических систем

при

комнатной

низких темпера-

турах.

Общая

характеристика

метода

импульсной спектроскопии

Для исследования кинетики быстропротекающих фотопроцессов

еще

в 50-х

годах

был

предложен

метод

флеш-фотолиза,

или им-

пульсной

спектроскопии.

Метод заключается

том,

что при

освеще-

нии

объекта кратковременной мощной вспышкой света поглощаю-

щие свет молекулы, переходя

возбужденное состояние,

могут

на-

капливаться

избыточной концентрации.

При

этом образуются

промежуточные короткоживущие фотопродукты. Если вслед

за

мощной

возбуждающей вспышкой через определенный промежуток

времени освещать объект более слабым измеряющим светом

в им-

пульсном режиме

или в

виде светового потока постоянной интенсив-

ности,

то

можно зарегистрировать кинетику изменений поглощения

(при

определенной

К) или

спектр поглощения таких короткоживу-

щих компонентов (фотопродуктов). Общие принципы лазерной

пико-

-секундной спектроскопии изложены далее, здесь лишь

будут

рас-

смотрены методики

применением импульсных ламп.

По

способу регистрации различают несколько модификаций мето-

да импульсной спектроскопии.

Первый

вариант

модификации

за-

ключается

в том, что в

качестве источника измеряющего света

используют импульсную лампу,

вспышки возбуждающего

и ре-

гистрирующего света синхронизированы

по

времени. Таким обра-

зом,

спектр поглощения можно зарегистрировать через определен-

ные временные интервалы, следующие

за

возбуждающей вспышкой.

помощью этого метода можно измерять кинетику концентрацион-

ных изменений возбужденных молекул компонентов. Однако

чувст-

вительность этого метода невысока

составляет

среднем около

5—10

надежно регистрируемых изменений поглощения; невели-

ка,

кроме того, точность определения временных характеристик

из

анализа кинетических кривых.

Во

втором

варианте

качестве измеряющего света используют

постоянный

источник (лампу постоянного горения).

этом

случае

регистрируют изменение поглощения

при

разных длинах волн,

а за-

тем

по

точкам строят дифференциальный спектр поглощения. Этот

метод более чувствителен, он позволяет более надежно исследовать

кинетику фотохимических превращений.

Третий

вариант

модификации состоит в том, что после

возбуж-

дающей вспышки измеряющий свет, который подается на объекг

импульсном или постоянном режиме, регистрируется спектрофото-

метром со скоростной разверткой для «мгновенной» записи спект-

ральной кривой изменений поглощения (например, за 10~

с).

Использование импульсной техники получило большое распро-

странение при изучении фотопроцессов in

vitro

(фотопревращений

красителей, например в

результате

триплет-триплетного поглоще-

ния;

фотосинтетических пигментов и т.п.). Однако применение этих

методов при исследовании биологических объектов встречает ряд

трудностей вследствие низких концентраций образующихся фотопро-

дуктов, гетерогенности образцов, большого светорассеяния. В не-

которых лабораториях

удалось

создать дифференциальные импульс-

ные спектрофотометры для биологических исследований. Конструк-

ция

таких приборов обеспечивала условия, при которых объект мог

возбуждаться серией последовательных вспышек света, что позволя-

ло увеличивать полезный сигнал и использовать технику его

накоп-

ления

случае

малых изменений поглощения. Существенно, что при-

менение серии возбуждающих вспышек важно не только для

накоп-

ления

сигнала, но и в том

случае,

если характер кинетических изме-

нений

и их величина зависят от номера вспышки (например, как это-

наблюдается при изучении кислородвыделяющей системы фотосин-

тезирующих организмов, так называемых S-состояний). Методом

импульсной дифференциальной спектроскопии было установлено,

что время переноса электрона по электрон-транспортной цепи фото-

синтеза составляет 10~

— 10~

с.

На

рис. 31 представлена

схема

импульсного спектрофотометра,

сконструированного на кафедре биофизики Биологического факуль-

тета

МГУ для биологических исследований.

Измеряющий

свет

от

источника (лампа накаливания

90 Вт) /

фокусирует-

ся

линзой

2 на

входную

щель монохроматора

Монохроматический

луч све-

та

помощью линзы

фокусируется

на

кювету

образцом. Проходя кювету,

луч света падает

на

стеклянную пластинку

19,

расположенную

под

углом

45-',

которая отражает около

12 %

падающего

на нее

света. Таким

об-

разом,

часть света через стеклянную пластинку

светофильтр

попадает

на

фотокатод первого фотоумножителя

21, а

часть, отражаясь

поворачива-

ясь

зеркалом

14,

через светофильтр

15 на

фотокатод второго фотоумножите-

ля

16.

Импульсное возбуждение производится двумя лампами

10, 13, рас-

положенными

параллельно оптической

оси, от

которых свет через свето-

фильтры

11, 12

попадает

на

кювету

образцом. Энергия вспышки

для

боль-

шинства

измерений

30—40

Дж,

длительность

5- 10~* с.

Для обычного светового возбуждения (постоянный свет) используют

лам-

пу накаливания

(750 Вт) 5, от

которой

луч

через систему линз

6, 8,

тепловой

стеклянный

светофильтры попадает

на

образец. Интенсивность измери-

тельного света составляла около

10~

Вт-см~~

постоянного возбуждающе-

го света —около

10 "

Импульсное возбуждение производится однократными

или

последовательными двумя вспышками через регулируемые интервалы

времени

от 50 мкс до

нескольких минут. Электрический сигнал

от

первого

фо-

4cz{H

20 21 22 23

Рис.

31.

Схема импульсного дифференциального спектрофотометра (объяс-

нение

см. в

тексте)

тоумножителя поступает

на

эмиттерный повторитель

22,

затем

на

широкопо-

лосный

усилитель

23 и

регистрирующий прибор (осциллограф)

24. Со

второ-

го фотоумножителя сигнал усиливается электрометрическим усилителем

по-

стоянного

тока

17 и

поступает

на

самопишущий потенциометр

18.

Схема

ре-

гистрации обеспечивает чувствительность порядка

0,2 % ДО.

Установка

по-

зволяет регистрировать кинетику

«быстрых»

процессов

характерными

вре-

менами

т > Ю-

с.

Исследование процессов, протекающих

за

более короткие

времена, производят

на

установках

лазерным возбуждением

(см. §2 гл. III).

Метод

поляризационной

дифференциальной

абсорбционной

спектрофотометрии

(фотоселекция,

спектры

фотоиндуцированных

изменений

линейного

кругового

дихроизма)

Для получения дополнительной информации о характере индуци-

рованных изменений наряду с обычной дифференциальной спектро-

фотометрией применяют

поляризационную

дифференциальную

аб-

сорбционную

спектрофотометрию,

с помощью которой

исследуют

не

только обычные параметры изменений поглощения (величину А£>,

кинетические кривые, характерные времена), но и ориентацию ди-

польных моментов переходов таких изменений относительно пло-

скости поляризации действующего света или относительно осей сим-

метрии изучаемой системы. Можно следить также за изменением ха-

рактера взаимодействия

между

хромофорами и конформационными

перестройками макромолекул.

Наконец,

можно производить селек-

тивную фотодеструкцию определенным образом ориентированных мо-

лекул при действии на образец поляризованным световым потоком.

Метод

фотоселекции.

Этот метод заключается в том, что изотроп-

ная

система (хаотически ориентированные молекулы образца) ос-

вещается плоскополяризованным действующим светом, который

создает анизотропию, за

счет

преимущественного возбуждения моле-

кул с моментами переходов p.

параллельными электрическому век-

тору Е действующего света. Вызванные этим вертикально поляри-

зованным светом изменения поглощения образца зондируются из-

меряющим лучом, поляризованным вначале параллельно, а затем

перпендикулярно поляризации действующего

луча.

На рис. 32 при-

ведена наглядная схема, иллюстрирующая метод фотоселекции.

Вероятность того, что молекула, имеющая момент перехода ц,

перейдет в возбужденное состояние при освещении действующим вер-

тикально поляризованным светом (вектор Е параллелен оси г),

будет

пропорциональна cos'

(j>, где ф —

угол

между

ц и осью г.

Отсюда ясно, что главным образом

будут

возбуждаться молекулы,

моменты переходов которых параллельны оси z.

Возбуждающий свет в зависимости от условий эксперимента мо-

жет быть импульсным или постоянным. Дихроизм светоиндуциро-

ванных изменений поглощения определяется в виде отношения

(АЛ,, — АЛ

^)/(АЛ

,| + АЛ

), где Р — коэффициент поля-

ризации,

или в виде дихроичного отношения Ь-- АЛ ц/АЛ

(АЛ

и АЛ

—величины изменений поглощения при параллель-

ной

и перпендикулярной поляризации измеряющего

луча

соответ-

ственно).

Варьируя длину волны измеряющего света, можно за-

регистрировать кинетические кривые фотоиндуцированных из-

менений

поглощения для параллельной и перпендикулярной

поляризации

при различных к, а затем по точкам построить спектр

поляризации

(Р

=--

f (X)), дихроичного отношения (D

=--

/ (к)) или

дифференциальные спектры (АЛ

= / (к) и АЛ

~ f (к)).

Рис.

32. Иллюстрация метода фотоселекции (объяснение см. в тексте)

Формулы, выведенные для различных вариантов ориентации

объектов (см. § 5 гл. I), можно использовать и при фотоселек-

ции.

Однако в последнем

случае

(предварительно не ориенти-

рованный

образец) достичь идеальной ориентации фотоселекцией

невозможно, поскольку возбуждаться

будут

не только те молекулы,

для которых ji || Е || z (ф = 0) (рис. 32), но и

другие

молекулы с эф-

фективностью, пропорциональной сов

ф. Для объектов с осевой сим-

метрией предельные значения дихроичного отношения, опреде-

ляемые с помощью метода фотоселекции, равны 3 и 0,5 в

случае

параллельной и взаимно перпендикулярной ориентации электри-

ческого вектора возбуждающего и измеряющего света соответствен-

но.

Коэффициенты поляризации при этом достигают значений 0,5 и

— 1/3. В

случае

кругового вырождения возбуждающего или реги-

стрируемого перехода в экспериментах по фотоселекции дихроичное

отношение не может превышать 3/4, а коэффициент поляризации

не

может быть более 1/7. Существенно подчеркнуть, что если метод

измерения

линейного дихроизма

дает

возможность определить

углы

между

моментами перехода и осями симметрии исследуемого объ-

екта, то метод фотоселекции позволяет вычислить

углы

между

пара-

ми

переходных моментов. Использование обоих методов весьма же-

лательно для получения более полной информации об ориентации

таких переходов. Метод фотоселекции применяют и в том случае,

если специфика объекта не позволяет ориентировать его другими

способами.

Существуют

различные конструкции установок для исследова-

ния

объектов методом фотоселекции. Обычно это дифференциальные

импульсные установки, принцип работы которых был рассмотрен

выше. Возбуждение производится импульсными лампами в режиме

либо одиночных вспышек, либо серий вспышек,

следующих

с раз-

личными временными интервалами. При фотоселекции исполь-

зуется вертикально поляризованный свет. Измеряющий монохро-

матический свет, поляризованный в

двух

взаимно перпендикуляр-

ных направлениях (параллельном и перпендикулярном направле-

нию

ориентации плоскости поляризации возбуждающего света),

зондирует объект в течение определенного промежутка времени,

что зависит от условий эксперимента.

Так,

при изучении иммобилизованных частиц фотосистемы I выс-

ших растений с помощью фотоселекции использовали модификацию

импульсного дифференциального спектрофотометра, применяемого

для исследования фотоиндуцированных изменений поглощения

с временными параметрами 10~

— 10~

с.

Образец, помещенный в специальное кюветное отделение, осве-

щался возбуждающей вспышкой света (от ксеноновой лампы), про-

ходящего предварительно интерференционные светофильтры и не-

подвижный поляроид. Длительность вспышки составляла около

15 мкс. Измеряющий свет через монохроматор и подвижный поля-

роид, поворот которого обеспечивал изменение направления плоско-