Рубин А.Б. Современные методы биофизических исследований (Практикум по биофизике)

Подождите немного. Документ загружается.

ю—ь

•

t*—t

Рис.

36.

Схема установки

для

измерения фотоиндуцированных

выхода

флуоресценции (объяснение

см. в

тексте)

изменений

Измеряющий

свет

от

источника

(лампа накаливания) через фокусирую-

щую линзу

попадает

на

высокочастотный модулятор

(секторный вращаю-

щийся

диск),

затем через стеклянный светофильтр

4 на

входную

щель моно-

хроматора

Монохроматический

луч

света

возбуждает

флуоресценцию

объ-

екта, помещенного

плоскопараллельную кювету

14,

расположенную

под уг-

лом

45° к

измеряющему

действующему

лучу.

Кювета находится

во

внут-

реннем

неподвижном стакане фосфороскопа

13.

Фосфороскоп представляет

собой

три

коаксиальных цилиндра: внутренний

внешний цилиндры

не-

подвижны

имеют четыре окна, расположенные через

средний стакан

вращается

имеет

два

окна

—

через

180°.

Флуоресценция

от

объекта,

воз-

буждаемая измеряющим светом, выделяется стеклянными светофильтрами

11,

может регистрироваться либо

на

просвет

помощью фотоумножителя,

расположенного

за

объектом

16,

либо

передней стенки кюветы

помощью

плоского зеркала

12 и

другого

фотоумножителя

10. В

последнем

случае

влия-

ние

реабсорбции сказывается меньше.

Действующий свет, вызывающий фотоиндуцированные изменения,

от ис-

точника

(лампа накаливания

750 Вт)

попадает

на

кювету

образцом,

про-

ходя

последовательно фокусирующую линзу

18,

тепловой фильтр

19,

фотозат-

вор

20 и

светофильтр

21. Как уже

отмечалось, можно использовать

два

источ-

ника

действующего света. Модулированный сигнал

от

фотоумножителя

по-

ступает

на

узкополосный усилитель

настроенный

на

частоту

модуляции

из-

меряющего света

(4,3 кГц), а

затем выпрямляется

8 и

регистрируется само-

писцем

7 или

осциллографом

6. При

другой

схеме

регистрации можно исполь-

зовать самописец

22 и

высокоомный вольтметр

23.

При

работе фосфороскопа (измеряющий и действующий свет

модулированы с одинаковой частотой) время освещения образца

измерительным и действующим светом и темновой интервал между

ними

составляет 2,5 мс, а темновой интервал между двумя последо-

вательными вспышками для каждого из световых потоков — 10 мс.

101

Применение

фосфороскопа исключает попадание

на

фотокатод фото-

умножителя рассеянного действующего света

фоновой флуорес-

ценции.

Дополнительную высокочастотную модуляцию измеряю-

щего

луча

использовали

для

того, чтобы исключить влияние

по-

слесвечения, возбуждаемого действующим светом,

на

регистра-

цию изменений выхода флуоресценции. Постоянная времени

уста-

новки

при

измерении фотоиндуцированных изменений флуоресцен-

ции

зависимости

от

экспериментальных условий составляла 10

-1

—

— 10~

с, а

чувствительность

— от 3 до 15%.

Для измерения переменной флуоресценции фотосинтезирую-

щих организмов

на

кафедре биофизики Биологического факультета

МГУ

был

сконструирован импульсный флуорометр. Этот прибор

позволяет регистрировать

выход

флуоресценции, который изменяет-

ся

от

минимального уровня

при

открытых реакционных цент-

рах (РЦ), возникающего вследствие потери части энергии возбуж-

дения

за

время миграции

к РЦ, до

максимального уровня /•'max

при

закрытых

РЦ

вследствие восстановления первичного акцеп-

тора электронов. Переменная флуоресценция

= F

max

— F

)

этих условиях позволяет судить

состоянии РЦ, скоростях

вос-

становления акцепторов

других

параметрах первичных реакций

при

фотосинтезе.

Принцип

действия установки заключается

том,

что

объект

ос-

вещается слабыми импульсами света, возбуждающими флуоресцен-

цию

на

уровне

;

затем включается более интенсивный действую-

щий

свет

режиме постоянного горения (при этом

объекту обыч-

но

добавляют диурон

—

ингибитор электронного транспорта)

регистрируется максимальный уровень флуоресценции

max

. Та-

ким

образом, поскольку измеряющим является импульсный свет

каждый импульс индуцирует флуоресценцию, которая регистри-

руется фотоумножителем, сопряженным

импульсным цифровым

вольтметром

цифроаналоговым преобразователем,

условиях

из-

мерения Fmax энергия импульсного света, использовавшаяся

при

открытых РЦ для разделения зарядов, высвечивается

виде импуль-

сов флуоресценции

прибор фиксирует максимальный уровень

miX

После выключения действующего света происходит релакса-

ция

флуоресценции.

На

рис.

приведена схема установки.

Измеряющий

свет

от

импульсного источника (лампы-вспышки

соединен-

ной

блоком питания

управления

через фокусирующую линзу

5 и

свето-

фильтры

попадает

кюветное отделение

—

светонепроницаемую камеру,

которая

представляет собой неподвижный стакан

8 с

внутренним коаксиаль-

ным

цилиндрическим затвором

Входные

выходные окна расположены

под

углом

90°.

Свет через входное окно попадает

на

кювету

образцом

10,

закрепленную

кюветодержателе

//.

Свет флуоресценции

от

объекта через

систему светофильтров

попадает

на

фотокатод фотоумножителя

13.

Сигнал

от

фотоумножителя регистрируется импульсным вольтметром

15,

цифроаналоговым

преобразователем

поступает

на

самопишущий потен-

циометр

17.

Фотоумножитель соединен

высоковольтным стабилизато-

ром

14.

Кюветодержатель имеет проточную

сие ему

сопряжен

термоста-

том

7. В

качестве действующего света применена галогенная лампа накали-

102

Рис.

37. Схема

двухлучевого

импульсного флуорометра (объяснение см.

тексте)

вания

2 с источником постоянного тока /. Действующий свет попадает в кю-

ветное

отделение через то же

окно,

что и измеряющий свет, который генери-

руется в режиме одиночных импульсов с заданной частотой следования и дли-

тельностью 40 мкс. Фотокатод фотоумножителя защищен от попадания на не-

го измеряющего и действующего света с помощью красного светофильтра

(КС-15),

который скрещен со светофильтрами

(СЗС-21,

СС-4),

пропускаю-

щими

возбуждающий свет в синей области спектра.

Метод

фотоиндуцированной

поляризации

флуоресценции.

Для

исследования динамических и

структурных

свойств макромолекул

успехом

применяют

метод

фотоиндуцированной поляризации флуо-

ресценции,

который, так же как и

метод

фотодихроизма, основан на

принципе

фотоселекции, когда анизотропия пространственного рас-

пределения возбужденных молекул создается линейно поляризован-

ным

действующим светом. Излучение, таким образом, оказывается

частично поляризованным.

Вследствие

броуновского движения моле-

кул анизотропия со временем частично или полностью нарушается

излучающие молекулы вновь оказываются распределенными изот-

ропно.

Такой процесс, как было отмечено ранее, характеризуется

значением времени вращательной релаксации р, зависящим от тем-

пературы и вязкости среды, а также от объема, формы и внутримо-

лекулярной подвижности макромолекулы. Поляризация флуорес-

ценции

зависит также от интервала времени

между

поглощением

света и его излучением. Таким образом, чем больше время жизни

возбужденного состояния т, тем больше вероятность флуоресцирую-

103

щих молекул потерять свою ориентацию вследствие броуновского

движения.

Различают два

способа

измерений

поляризации:

стационарный,

позволяющий

получить динамические характеристики макромоле-

кул, усредненные по всему их ансамблю и по времени, и импульсный,

дающий возможность разделить различные моды броуновского вра-

щения

макромолекулы и ее сегментов, которые вносят вклад в сум-

марную деполяризацию флуоресценции. При

стационарном

методе

для возбуждения используют непрерывный пучок, при импульс-

ном

— короткую вспышку вертикально поляризованного света.

Принципиальная

основа этих методов изложена в § 5 гл. II.

Для исследования методом поляризации нефлуоресцирующих

или

слабофлуоресцирующих макромолекул используют флуорес-

центные

метки. В этом

случае

в соответствии с формулой

Вебера

1/Я-1/3

_j Зт

= }

т Т

1/Р

-1/3

со

г) '

где Р и А — значения поляризации и анизотропии флуоресценции,

и А

— предельные значения этих параметров в

отсутствие

бро-

уновского вращения, т — время жизни флуоресценции метки, ц —

вязкость

среды, Т — абсолютная температура, со

— коэффициент

пропорциональности,

зависящий от параметров макромолекулы,

— среднее гармоническое

трех

основных времён релаксации

эллипсоида,

которым аппроксимируется макромолекула, вокруг

трех

его осей.

Вывод этого уравнения основан на предположениях о том, что

молекулы метки изотропно распределены по поверхности макромо-

лекулы и жестко с ней связаны, а флуоресценция

затухает

по

экспо-

ненциальному

закону. Поскольку в соответствии с уравнением Ве-

бера наклон прямой в координатах МР и Т/ц определяется соот-

ношением

т/со

, то, измерив в независимом эксперименте величину т,

можно

вычислить значение (о

или p

для данного отношения Т/ц,

пользуясь графиком МР — f

(Т/ц).

Обычно вычисляют стандарт-

ное

значение для Т/ц =

3,34-10

град/(Па-с), что

соответствует

водному раствору при 25 °С. Если метка имеет термально активи-

руемое

собственное вращение относительно макромолекулы, то

случае

анизотропного и быстрого вращения метки можно рассмат-

ривать движения макромолекулы и метки раздельно и определять

величину р

с достаточной точностью из экспериментально получен-

ных изотерм зависимости МР от Т/ц.

Для непосредственного наблюдения временных зависимостей за-

тухания флуоресценции F (t) и ее анизотропии A (t) используют

импульсный

метод

поляризации флуоресценции. Эти зависимости

представляют в виде суммы

двух

экспонент:

104

где a

, 6,, Ь

— коэффициенты, <р — время вращательной кор-

реляции,

т — время жизни возбужденного состояния.

Время вращательной корреляции связано с временем враща-

тельной релаксации соотношением ср ~ (1/3) р. Из эксперименталь-

ных данных определяют значения ф

ср

, х

, т

и предэкспонен-

циальные коэффициенты. Эти вычисления обычно производят на

ЭВМ методом моментов. В настоящее время описанные выше методы

уже достаточно широко используют. Так, в Институте молекуляр-

ной

биологии АН

СССР

(лаборатория

физики

биополимеров) мето-

дом поляризации флуоресценции подробно изучены динамические и

структурные свойства иммуноглобулинов, что может иметь непо-

средственное отношение к выяснению механизмов функционирования

иммунной системы и, в частности, механизмов биологической ак-

тивности антител.

Измерение

поляризации фотоиндуцированных изменений флуо-

ресценции

имеет большое значение для исследования структурно-

функциональной

организации фотосинтетического аппарата. Так,

изучение

поляризации

переменной

флуоресценции

ориентированных

клеток водорослей, хлоропластов, фотосинтетических мембран и

пигмент-белковых комплексов

дает

информацию об ориентации ди-

польных моментов переходов пигмента реакционных центров и бли-

жайших к нему антенных форм хлорофилла а. Показано, что эти

переходы ориентированы практически параллельно плоскости фо-

тосинтетической мембраны. Измерения поляризации переменной

флуоресценции производят обычно на установках, предназначенных

для регистрации фотоиндуцированных изменений флуоресценции

с применением поляроидов. Более подробно это

будет

изложено при

описании

установки для исследования замедленной флуоресцен-

ции

и фотоиндуцированных изменений быстрой флуоресценции

§ 8.

8. Методы измерения замедленной флуоресценции

При

исследованиях первичных процессов фотосинтеза широко ис-

пользуют метод регистрации различных характеристик (кинетики,

времени жизни, спектрального состава) замедленной флуоресцен-

ции

(послесвечения). Длительное послесвечение фотосинтезирую-

щих организмов можно отнести к индуцируемому свечению. По-

скольку, как было показано, спектральный состав флуоресценции и

послесвечения идентичен, излучение в процессах такого послесве-

чения

обусловлено излучательной дезактивацией первого синглет-

ного возбужденного состояния хлорофилла (т. е. переходом S] -*-

- So + /н^-

Известно,

что обычная флуоресценция

затухает

за времена по-

рядка 10"

— 10^' с,

тогда

как послесвечение регистрируется в ин-

тервале от 0,5 мкс до нескольких минут. Таким образом, первое воз-

бужденное синглетное состояние хлорофилла может генерировать-

105

ся

и после выключения возбуждающего света, по-видимому, в

ходе

обратных процессов рекомбинации. Позже было установлено, что

возбужденное состояние S* генерируется вследствие рекомбинации

окисленного пигмента реакционного центра и восстановленного

акцептора электронов (Р

-f Q~ -*• Р + Q + hx). При этом источ-

ником

замедленной флуоресценции являются молекулы хлорофил-

ла а светособирающей антенны.

Отсюда

следует,

что

замедленная

флуоресценция

в данном слу-

чае — это фотоиндуцированное излучение светособирающих моле-

кул хлорофилла, возникающее за счет обратных реакций рекомби-

нации.

Кинетика затухания послесвечения представляет собой

экспоненциальную кривую, состоящую из нескольких компонентов

с различными временами жизни, что объясняется существованием

различных фотопродуктов. Превращения таких фотопродуктов мож-

но

зарегистрировать также с помощью метода низкотемпературной

гермолюминесценции. Не обсуждая подробно механизмы и природу

замедленной флуоресценции, описанные достаточно детально в спе-

циальной литературе, важно подчеркнуть, что измерение послесве-

чения

оказалось чрезвычайно информативным для изучения первич-

ных процессов фотосинтеза.

Для измерения замедленной флуоресценции применяют

уста-

новки

различной конструкции, что определяется прежде всего

временем жизни исследуемых компонентов. При регистрации долго-

живущих компонентов со времени жизни в пределах 0,1—1 с ис-

пользуют проточные системы. Исследуемая суспензия хлороплас-

тов или водорослей освещается действующим светом и перекачи-

вается по светонепроницаемой трубке к фотоумножителю, который

регистрирует послесвечение. Интервал

между

освещением и из-

мерением

будет

определяться в такой системе расстоянием от места

освещения до фотокатода и скоростью потока. Для измерения еще

более медленных компонентов послесвечения (т > 1 с)

существуют

конструкции, позволяющие перемещать кювету с образцом от ис-

точника света к фотоумножителю. Так, если закрепить образец

на

внутреннем подвижном цилиндре, который закрыт

сверху

ци-

линдрическим кожухом с двумя окнами под

углом

180° (одно — пе-

ред источником света, а

другое

— перед фотокатодом фотоумножи-

теля),

то при повороте такого цилиндра на 180° объект переместит-

ся

от источника света к фотоумножителю, регистрирующему после-

рвечение. Интервал

между

освещением и измерением определяется

этом

случае

скоростью поворота внутреннего цилиндра.

В установках для регистрации короткоживущих компонентов

послесвечения (т = 10~

~ 10~

с) используют фосфороскопиче-

ские устройства (вращающийся цилиндр с окнами или секторные

диски).

Блок-схема установки с цилиндрическим фосфороскопом пред-

ставлена на рис. 38.

106

Рис.

38.

Схема установки

для

измерения короткоживущих компонентов

по-

слесвечения (объяснение

см. в

тексте)

Фосфороскопическое

устройство состоит из трех коаксиальных

цилиндров,

зазор между которыми составляет 0,5 мм. Внешний и

внутренний цилиндры неподвижны, содержат по три окна, два из

которых расположены под углом 90° и используются для возбужде-

ния

послесвечения. Третье окно служит для регистрации, располо-

жено перед фотоумножителем и под углом 135° к окнам для возбуж-

дающего света. Средний, вращающийся, цилиндр (частота вращения

3000

об/мин) имеет четыре окна под углом 90°

друг

другу.

Темно-

вой интервал между моментом освещения и регистрации состав-

ляет 2,5 мс.

Возбуждающий свет

от

источника (лампа накаливания

750 Вт с

водяным

воздушным охлаждением

/ или

импульсная лампа-вспышка

через фокуси-

рующую

линзу

3 и

светофильтр

проходит через входное окно фосфороскопа

попадает

на

кювету

образцом

помещенную

во

внутреннем цилиндре

около выходного окна.

случае

монохроматического освещения

воз-

буждающий свет

от

другого

источника (лампа накаливания

300 Вт) 7,

проходя через фокусирующую линзу

монохроматор

9 и

второе входное

окно

фосфороскопа попадает

на

кювету

образцом. Индуцируемое послесвече-

ние

регистрируется фотоумножителем

//,

расположенным

за

выходным

ок-

ном

фосфороскопа. Перед фотокатодом фотоумножителя помещается свето-

фильтр

10 для

того, чтобы избавиться

от

рассеянного возбуждающего света.

Сигнал

от

фотоумножителя

помощью реле

переключается

на

любой

из двух

каналов усиления.

первом канале фототок усиливается электрометриче-

ским

усилителем постоянного тока

14, а

затем регистрируется самопишущим

потенциометром

17.

Второй канал используется

при

изучении быстрых пере-

ходных

процессов послесвечения

при

включении

выключении возбуждаю-

щего света. Усиление переменного электрического сигнала производится

усилителам переменного тока

15 и

регистрируется осциллографом

16,

рабо-

тающим

режиме ждущей развертки, синхронизированной

фотозатвором

который перекрывает возбуждающий свет

за

время порядка

4 мс.

Питание

фотоумножителя осуществляется

от

высоковольтного стабилизатора

13.

107

Благодаря системе двухканального усиления установка позволяет прово

дить измерения послесвечения

как в

стационарном режиме освещения,

так и

случае

быстрых переходных процессов, происходящих

при

включении

или

выключении возбуждающего света.

последнем

случае

качестве источника

света может быть использована также

импульсная лампа

На

кафедре биофизики Биологического факультета МГУ была

сконструирована установка, позволяющая измерять как замедлен-

ную флуоресцению, так и

фотоиндуцированные

изменения

быстрой

флуоресценции.

Этот прибор представляет собой модифицирован-

ную установку с фосфороскопом для регистрации миллисекундного

послесвечения, описанную выше.

В этой установке также применяется фосфороскоп, состоящий

из

трех

коаксиальных цилиндров. Внутренний

внешний неподвижные цилиндры

содержат

по три

окна:

два

входных

для

действующего

измеряющего света

со-

ответственно

одно выходное

для

регистрации быстрой

или

замедленной

флу-

оресценции.

Входное

окно

для

измеряющего света расположено

под уг-

лом

180°, а

входное окно

для

действующего света—под

углом

115° к

выходно-

му окну

для

регистрации. Средний цилиндр, являющийся модулятором,

вра-

щается

частотой

5000

об/мин (частота модуляции

220 Гц,

темновой интер-

вал

1,3 мс) и

содержит восемь отверстий

под

углом

45°

друг

к другу.

Действующий свет применяют для возбуждения замедленной

флуоресценции и генерации фотоиндуцированных изменений быст-

рой

флуоресценции (например, переменной флуоресценции). Изме-

ряющий

свет используют для возбуждения быстрой флуоресценции.

Входное окно фосфороскопа для измеряющего света и выходное

окно

открываются одновременно. Для того чтобы измерить фотоин-

дуцированные изменения быстрой флуоресценции и исключить при

этом регистрацию замедленной флуоресценции, измеряющий и дей-

ствующий лучи модулируются с различной частотой. Селективный

усилитель настроен на частоту модуляции измеряющего

луча

(воз-

буждающего быструю флуоресценцию), которая осуществляется

механическим дисковым модулятором света (частота модуляции

4900

Гц). Схема установки представлена на рис. 39.

Действующий свет

от

лампы накаливания

тепловым фильтром (интен-

сивность

4-10~

Вт/см

)

/ или от

стробоскопической лампы-вспышки (энер-

гия

импульса

4 Дж, т ss 1 мке) 2

через фокусирующую линзу

3 и

светофильтр

4 проходит через входное окно фосфороскопа

фокусируется второй линзой

на

кювету

образцом

помещенную

во

внутренний цилиндр непосредствен-

но

перед выходным окном. Измерительный свет

от

другого

источника

7 (лам-

па

накаливания КГМ-75), фокусируясь линзой

попадает

на

дисковый

мо-

дулятор света

9 или

фотозатвор

10 (при

использовании немодулированного

света), проходит светофильтры

//,

второе входное окно фосфороскопа

12,

фокусируется линзой

13 на

зеркало

14 и

попадает

на

кювету

образцом. Излу-

чаемый объектом свет флуоресценции

или

послесвечения

(в

зависимости

от

условий возбуждения) через светофильтр

16,

перед которым

при

необходимо-

сти может быть помещен вращающийся поляроид

15,

попадает

на

фотока-

тод фотоумножителя

17.

Питание

фотоумножителя осуществляется

от

высоковольтного стабили-

затора

18. В

систему питания лампы-вспышки

входят

источник питания

19,

блок поджига

20 и

синхронизации

21.

Сигнал

фотоумножителя через пере-

108

19 20

-J

•a

1 \.

Рис.

39.

Схема

установки для раздельной регистрации замедленной флуоресценции и фотоиндуциро-

ванных изменений быстрой флуоресценции (объяснение см. в тексте)

ключатель режимов регистрации

поступает либо

на

селективный микро-

вольтметр

23,

настроенный

на

частоту

4900

Гц,

затем

на

полосовой фильтр

24,

выпрямитель

27 и

самописец

30,

либо

на

усилитель постоянного тока

26 и

другой

самописец

29.

Сигнал после усиления

может регистрировать-

ся

также

осциллографом

28.

Первый

канал регистрации предназначен

для

измерения фотоиндуци-

рованных изменений быстрой флуоресценции

—

селективный усилитель,

настроенный

на

частоту

модуляции

4900

Гц

(дисковый модулятор), отсекает

сигнал

от

замедленной флуоресценции, который модулирован

частотой

220

Гц

(фосфороскоп).

Второй канал регистрирует индукционные кривые замедленной флуорес-

ценции

при

постоянном освещении объекта

—

сигнал попадает

усилитель

постоянного тока.

Для регистрации затухания замедленной флуоресценции при им-

пульсном освещении используют осциллограф с запоминающим уст-

ройством, сигнал на который поступает от усилителя переменного

тока.

Установка может быть использована и для регистрации индук-

ционных

кривых быстрой флуоресценции. В этом

случае

измеряю-

щий

свет является одновременно и действующим, а вместо дискового

модулятора используется фотозатвор (рис. 39).

помощью данной установки можно также проводить измерение

поляризации

быстрой

замедленной

флуоресценции.

Для этого об-

разцы (хлоропласты, фотосинтетические мембраны, клетки водорос-

лей) предварительно ориентируют, а затем фиксируют (например,

полиакриламидном

геле

или при низкой температуре). Ориентиро-

ванные образцы помещают в

кювету,

а после выходного окна фос-

фороскопа

перед светофильтром располагают вращающийся поляро-

ид 15. Замедленную или переменную

быструю

флуоресценцию изме-

ряют по описанной выше

схеме

при

двух

положениях поляроида,

соответствующих параллельной и перпендикулярной ориентации

плоскости поляризации излучения относительно оси или плоскости

ориентации исследуемого объекта (например, оси деформации геля

1ли плоскости фотосинтетических мембран).

Такой

метод позволяет получить информацию об ориентации ди-

польных моментов

перехода

фотоактивного пигмента реакционных

центров, и ближайших к ним антенных форм хлорофилла а, ис-

пускающих замедленную и переменную флуоресценцию. Так, для

фотосистемы II высших растений и водорослей установлено, что

дипольный момент

перехода

пигмента реакционного центра

в80

ориентирован практически параллельно плоскости фотосинтети-

ческой мембраны, а ближайший к нему антенный компонент хлоро-

филла а, участвующий в замедленной и переменной флуоресценции,

излучает

около

685—686

нм с ориентацией осциллятора, также

параллельной плоскости мембраны.

ПО