Кирица Е. Направленный синтез каротиноидов у дрожжей и перспектива их использования

Подождите немного. Документ загружается.

потребления обычных продуктов нереально. Необходимо создать продукты, обогащенные

витаминными и биологически активными добавками. К наиболее перспективным

пищевым добавкам относятся каротины (БУКИН, 1997). Из одной молекулы β-каротина в

организме образуется 2 молекулы провитамина А. Каротин, как и витамин А, относится к

незаменимым витаминам и должен поступать в организм человека и животных постоянно

(RUDIC şi coaut., 1995; ГОМБОЕВА и др., 1998). Витамин А крайне необходим для

нормального состояния кожи и слизистых оболочек глаза, бронхов и желудка. Недостаток

его ведет к воспалению верхних дыхательных путей и желудка и провоцирует

возникновение катарам, бронхитов, гастритов и язв. Роговица глаза становится сухой,

воспаляется и изъязвляется. Кожные покровы становятся грубыми, неэластичными

(СЕРГИЕНКО, 2001).

До недавнего времени каротин и каротиноиды использовали, главным образом, как

пищевую добавку (краситель), а не с целью повышения витаминной ценности продуктов

(БУКИН, 1991; ЧИБИЛЯЕВ, 1998; www.tereza.ru). Однако исследования последних лет

установили самостоятельные функции каротина. Он повышает защитные силы организма

против вредного действия радиационного облучения, образования злокачественных

опухолей (имеет так называемые радио - и канцерогенные свойства) (RUDIC, 1995;

БУКИН, 1997; BLACK, 1998). Доказано, что каротин понижает риск возникновения

сердечно-сосудистых и желудочно-кишечных заболеваний (FORTES, 1998; YONG, 2001).

В последние годы становится все более популярно применение каротинсодержащей

продукции в различных областях пищевой промышленности, таких как масложировая

(производство маргарина, масла коровьего, жиров, майонеза); молочная (производство

мороженого); хлебобулочная и макаронная (производство булок, батонов, макарон, рожек

лапши, чипсов); кондитерская (производство печенья, конфет) и сыроваренная

(производство сыра) (БЕРКЕР, 1990; CUNNIGHAM, 2001). Основными принципами

использования каротиноидов в производстве являются улучшение цвета продукта, если

цветонасыщение недостаточно и не отвечает ожиданиям потребителя, стандартизация

цвета и внешнего вида продуктов питания, например, компенсация сезонного цвета таких

продуктов как масло и сыр; восстановление цвета, утерянного в процессе производства;

придание бесцветному продукту соответствующий цвет и витаминизация продуктов

питания (V

ĂLĂSUTEAN, 1998; ДЕНИСОВ, 1999; http://www.iaci.ru). Полезные свойства

каротинов заключаются в том, что эти вещества предупреждают развитие онкологических

заболеваний, согласно данным Национального ракового Института США, повышают

иммунитет ко многим другим заболеваниям, являясь антиоксидантами, предотвращают

процессы старения в организме, являясь сильными радиопротекторами, способствуют

выводу тяжелых металлов из организма (ШЕЛЕПОВА, 1992; БУКИН,1997;

www.uralbiopharm.ru). β-каротин - это витамин роста и его постоянное потребление будет

увеличивать рост последующих поколений. Каротинсодержащие препараты

способствуют улучшению зрения, широко используются при лечении ожогов, язв, для

лечения больных в послеоперационном и постклимактерическом периоде, согласно

исследованиям Клиники лечебного питания Института питания РАМН, используются при

лечении колитов, геморроя, язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки

(ФОМИНА,1998; ДЕЕВ, 2004).

Использование каротинсодержащей продукции в парфюмерно-косметической

промышленности. В настоящее время выпускаются жирорастворимые формы

микробиологических каротинов, что позволяет широко использовать их в парфюмерно-

косметической промышленности (YOUNG et al., 2001). β-каротин является мощным

антиоксидантом, обеспечивающим в организме прерывание цепных свободнорадикальных

реакций, защиту макромолекул и биомембран клеток от повреждений, являясь серьезным

фактором повышения резистентности организма к различным патогенным воздействиям,

в том числе к новообразованиям (www.medi.ru). β-каротин усиливает регенерацию

многослойного эпителия, что позволяет его использовать в дерматологии, гинекологии,

при лечении заболеваний, связанных с поражением эпителия. При накожном применении

бета-каротин не только влияет на обменные процессы в самой коже, но и усваивается

через кожу, оказывая благоприятное воздействие на организм в целом. Введение β-

каротина в зубные пасты, крема, помады, шампуни, краску для волос позволяет

предупредить старение кожи, устранить морщины, раздражение, зуд, смягчить кожу,

уменьшить ее сухость, способствовать заживлению царапин, трещин, улучшить внешний

вид кожи и ее общее состояние (www.vitmarket.ua

Использование каротинсодержащей продукции в животноводстве.

Систематические исследования, проведенные на крупном рогатом скоте, подтвердили

теорию, согласно которой β-каротин является жизненно важным веществом и в некоторых

функциях не может быть заменен витамином А у животных, не получающих β-каротин в

достаточном количестве (КОЛЬЦОВА и др., 1984; ГОМБОЕВА, 1998). В результате

наблюдаются нарушения функций

организма, впоследствии приводящих к повреждениям

всех соответствующих органов. В результате этого, воспроизводительная способность

животного ухудшается (КАЛУНЯНЦ, 1980). Открытию β-каротина, как незаменимого

биокатализатора плодовитости, предшествовал ряд интересных наблюдений. Давно

известно, что животные во время летнего выпаса получают большое количество β-

каротина, тогда как в зимний период у них наблюдается его недостаток. Результаты

многочисленных экспериментов, проведенных в полевых условиях во многих странах

мира доказывают, что β-каротин оказывает положительное воздействие на плодовитость

крупного рогатого скота, при условии, что ухудшение плодовитости не обусловлено

другими грубыми недостатками в кормлении и содержании (ПЕТРУНЯКА, 1979;

www.biolab.angelcities.com). Иными словами, β-каротин может быть эффективным только

в том случае, если он является лимитирующим фактором в кормлении

сельскохозяйственных животных (http://vitamarket.com.ua).

Использование каротинсодержащей продукции в аквакультуре. Каротиноиды

являются веществами, которые входят в состав животных организмов. В мире животных,

благодаря каротиноидам, появляется окраска у рыб и других представителей морской

фауны (СОИН, 1975; МИКУЛИН, 1993). В настоящее время каротиноиды выпускаются

фирмой BASF в виде 10 %-ного сухого порошка в мелких гранулах. Это означает, что

активный ингредиент, каротиноид, заключен в оболочку и защищен микрокапсулой.

Микрокапсулы растворяются в пищеварительном тракте рыб, после чего каротиноид

абсорбируется и поступает в ткани – мишени, в которых проявляется эффект

пигментации. Для обеспечения эффективной пигментации рыб используются продукты

кантаксантин и астаксантин, как отдельно, так и в составе смесей (www.uniagro.ru;

ЧЕРНЯЕВ, 1988). Использование данных препаратов способствует усилению

сопротивляемости организма рыб к различным заболеваниям, повышает способность к

оплодотворению и подавляет мутации (КАРНАУХОВ, 1988). Для сохранения

выживаемости и интенсификации роста личинок рыб, широкое распространение находят

дрожжи, входящие в состав стартовых кормов для рыб (CADAR, 1990; МИКУЛИН,

2000).

Таким образом, библиографический анализ показал, что среди микроорганизмов,

обладающих способностью к биосинтезу каротиноидов можно выделить красные дрожжи

Sporobolomyces, Phaffia, Rhodosposporidium, Cryptococcus, Sporidiobolus, Sterigmatomyces

и Rhodotorula, которые способны продуцировать биомассу с высоким содержанием

каротиноидов. Дальнейшее развитие биотехнологии должно заключаться в разработке

эффективных методов получения микробной биомассы с высоким содержанием

каротиноидных пигментов путем использования различных физических и химических

факторов. Следовательно, остаются актуальными проблемы разработки новых способов

получения каротиноидов

микробиологическим путем и усовершенствование

применяемых методов. Высокая биологическая ценность каротиноидов, получаемых

микробиологическим путем, обеспечила их широкое применение в различных областях

пищевой, парфюмерно-косметической промышленности, а также в животноводстве и

аквакультуре в качестве биодобавок и каротинсодержащих препаратов. Необходимость

поиска высокопродуктивных штаммов дрожжей, способных синтезировать высокое

количество каротиноидов показала важность изучения особенностей каротиногенеза у

дрожжей под влиянием различных факторов, разработки различных способов

направленного синтеза каротиноидов и биотехнологии получения новых препаратов на

базе дрожжевых каротиноидов.

ГЛАВА 2

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования были проведены в течение 2001 - 2005 гг. в лаборатории

«Микробные продукты» Института Микробиологии АН РМ.

2.1 Предмет исследований

Предметом исследований служили 14 штаммов дрожжей рода Rhodotorula и

Sporobolomyces из рабочей коллекции лаборатории «Микробные продукты» и

Национальной Коллекции Непатогенных Микроорганизмов: Rhodotorula gracilis CNMN-

YS-02, Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03, Sporobolomyces pararoseus CNMN-YS-01,

Rhodotorula rubra CNMN-YS-09, Rhodotorula mucilaginosa CNMN-YS-10 и штаммы

Rhodotorula gracilis CNMN-YS-I/3, Rhodotorula gracilis CNMN-YS-I/4-04, Rhodotorula

gracilis CNMN-YS-II/6, Rhodotorula gracilis CNMN-YS-II/9, Rhodotorula gracilis CNMN-YS

- II/15, Rhodotorula gracilis CNMN-YS-V/12, Rhodotorula gracilis CNMN-YS-IV/14,

Rhodotorula gracilis CNMN-YS-II/5-05, Rhodotorula gracilis CNMN-YS-III/20-06,

полученные после γ-излучения культуры Rhodotorula gracilis CNMN-YS-02.

2.2 Питательные среды для культивирования каротинсинтезирующих дрожжей

Для сохранения культур и глубинного культивирования дрожжей были

использованы питательные среды:

1. Питательная среда на пивном сусле (LODDER, KREEGER VAN RIJ, 1952):

Размешивается 1 кг солодовой муки с 2,6 л водопроводной воды при постоянном

перемешивании в течение 3 часов при температуре 45°С, затем температуру поднимают

до 63°С, продолжая перемешивание еще 1 час. После фильтрации смесь стерилизуют 15

минут при 120°С (1 bar), повторно фильтруют и разбавляют до 15° Blg (определяют по

сахарометру). Достигается значение рН до 5,4.

Для получения агаризованного пивного сусла в жидкую среду добавляется 2%

агара и смесь стерилизуют при 110°С (1/2 bar)в течение 15 минут.

2. Среда Лундина (КВАСНИКОВ, 1986) следующего состава (г/л): (NH4)2SO4-

1.0; KH2PO4-1.0; NaCl- 0.5; MgSО4•7H2O-1.0; FeCl3•7H2O - следы; Сахароза – 40.0; Вода

водопроводная 1л; рН = 5,5.

3. Среда синтетическая – MS-1 (г/л) (КВАСНИКОВ, 1986): (NH4)2SO4-5.0;

KH2PO4-1.0; MgSО4•7H2O-0.5; CaCl2•2H2O-0.1; NaCl-0.1; Глюкоза-40.0; Вода

водопроводная 1л; рН = 5,5.

4. Питательная среда MZ - 30 (г/л) (MD 1328 ): Глицерин – 40.0; Меласса –

20.0; KH2PO4 – 1.0; NaCl – 0.5, MgSO

•7H

O-0,5; CaCl2 – 1.0; Fe2SО4•7H2O- 0, 00003

(следы); Вода водопроводная 1л; рН = 5,5 (USATÎI, 2002).

2.3. Биостимуляторы, индукторы и координационные соединения металлов

Для повышения биосинтетического потенциала дрожжей были использованы:

➣

Нетрадиционные источники питания - экстракты растительных шротов

агропромышленного производства – виноградный, томатный, яблочный.

Способ получения экстракта из отходов агропромышленного производства:

80,0-100,0 г сухого шрота разбавляется 1 литром водопроводной воды, стерилизуется

текучим паром (3 этапа). Экстракт фильтруют и определяют содержание общего сахара.

➣

Индукторы - растительные масла: подсолнечное, соевое, кукурузное, оливковое и

ретинол.

➣

Предшественники -ацетат натрия (NaCH3COO), ацетат цинка ([Zn(CH3COO)24Н2О)])

и лимонная кислота (С6Н8О7).

➣

Координационные соединения переходных металлов – [Zn(Gly)Dl-Ser)], [Zn(Dl-Ala)(L-

Ser)], предоставленные др. хим. наук Л. Чапуриной, Интситут Химии АНМ и

[Fe2NiO(CCl3COO)6(CH3OH)3], [Fe2Mn(CCl3COO)6(CH3OH)3], синтезированные

сотрудниками Института Химии АНМ, под руководством академика К. Турта,

институт Химии АНМ.

2.4. Аппаратура и оборудование

Термостат ТС-80М-2 (Россия);

Автоклав (ГК/100/3);

Спектрофотометр SF -26;

Аминокислотный анализатор ААА-339 «Microtehnica» (Чехия);

Центрифуга – MPW -310 (Польша);

Весы «ВТ -500»;

Аналитические весы – ВЛР – 200;

Качалка – КВ-357;

Роторный испаритель.

2.5. Реактивы

В ходе исследований были использованы:

- углеводы: глюкоза, сахароза, мальтоза, инозит, маннит, лактоза, рамноза, арабиноза,

галактоза, ксилоза и глицерин;

- соли: (NH4)2SO4; KH2PO4; MgSO47H2O; FeSO46H2O; CaCl2; NaCl, ,Cu SO

; KMnO

;

- химические реагенты: петролейный эфир, гексан, ацетон, соляная кислота, диэтиловый

эфир, хлороформ, спирт, безводный сернокислый натрий, окись алюминия (III и IV

степени по Брокману).

2.6. Методы исследований

 Морфокультуральные и физиологические свойства штамма Rhodotorula

gracilis CNM – YS–03 были изучены согласно методам, описанным в

специализированной литературе (БАБЬЕВА, ГОЛУБЕВ, 1979; KREGER –

VAN RIJ, 1984).

 Аминокислотный состав идентифицировали на анализаторе ААА-339

«Microtehnica» (Чехия) классическим методом (Новые методы анализа

аминокислот, 1974). Исследования проводились совместно с сотрудниками

Центра Метрологии и Автоматизации научных исследований Академии Наук

Молдовы.

 Определение продуктивности дрожжей проводилось согласно

классическому методу (Руководство к практическим занятиям по

микробиологии, 1995).

 Количественное определение сахаров по Бертрану (Большой практикум по

микробиологии, 1962).

 Определение содержания внутриклеточных липидов по методу Bligh и Dyer

(КЕЙТС, 1975).

 Методы исследования каротиноидных пигментов

а) Экстракция пигментов:

- микробная биомасса доводится до концентрации 10мг/мл дистиллированной

водой;

- клетки дрожжей разрушаются методом гидролиза 1N HCl в течении 15 минут на

водяной бане при температуре 90°С;

- экстракция пигментов проводится на основании модифицированного метода

Петерсона (PETERSON et al., 1958; Каротинсинтезирующие дрожжи, 1980).

б) Колоночная хроматография, на окиси алюминия III и IV степени по Брокману

(ВАКУЛОВА Л.А., КУЗНЕЦОВА А.И., 1964, TĂMAŞ, NEAMŢU, 1986; ТЕРЕШИНА

В.М., 1994).

в) Идентификация каротиноидных пигментов производится на основании

спектров поглощения света каротиноидами (TĂMAŞ, NEAMŢU, 1986; БРИТТОН, 1986;

ТЕРЕШИНА, 1994).

Определение количества хроматографически очищенных пигментов:

С=D•V•10000/E•P

Где: С - содержание каротиноидов, мкг/г А.С.В.;

D - оптическая плотность раствора по максимуму поглощения;

V - объем элюата, мл;

E - коэффициент экстинкции соответствующего пигмента;

Р - навеска сухой биомассы, взятой на экстракцию, г.

г) Определение содержания каротиноидов в смеси (без предварительного

разделения) (Вечер, Куликова, 1980):

1. Определение концентрации каротиноидов (мкг/мл):

C1= 3,9•D450+1,8•D537-3,6•D509

C2= 5,3•D509-6,7•D537

C3= 6,7•D537-1,1•D509

Где: С1- концентрация β-каротина, мкг/мл;

С2-концентрация торулина, мкг/мл;

D450 - оптическая плотность раствора при 450 нм;

D509- оптическая плотность раствора при 507 нм;

D537- оптическая плотность раствора при 450 нм;

2. Определение количества каротиноидов (мкг/г А.С.В.):

A=C•V/m

Где: А - количество каротиноидов (мкг/г А.С.В.);

С - концентрация каротиноидов, мкг/мл, по максимуму поглощения;

V – объем элюата, мл;

m - навеска сухой биомассы, взятой на экстракцию, г.

 Определение содержания цинка в биомассе дрожжей

Используется спектрофотометрический метод (пат. MD 1701, 2001) определения

цинка, состоящий из следующих этапов:

1. разделение, разрушение и кислотный гидролиз биомассы.

2. отделение, экстракция и определение цинка.

3. обработка результатов:

Расчет количества цинк (мг %) производится на основе уравнения:

Zn (мг %) = [Аэкстракт - КАэкстракт]100/33,3 m,

538 620

Где: А Zn - оптическая плотность дитизоната цинка при длине волны 538 нм;

Аэкстракт – оптическая плотность экстракта при длине волны 538 нм;

538

Аэкстракт - оптическая плотность экстракта при длине волны 620 нм.

620

К - константа, представляющая собой отношение между оптической плотностью

при 538 нм 620 нм для чистого дитизона.

33,3 – коэффициент пересчета содержания цинка.

m – масса пробы, взятой для определения, г.

 Количественное определение гликогена

В пробирки наливают по 0,5 мл раствора, содержащего 20 -200 мкг гликогена

(испытуемая проба) и 50, 100 и 200 мкг глюкозы (для построения стандартной кривой).

Для

контроля на реактивы в две пробирки наливают по 0,5 мл воды. Во все пробирки

приливают по 5 мл антронового реактива. Добавление реактива следует проводить

быстро, так, чтобы струя реактива попадала в центр проб. Для этого используют пипетку с

широким носиком. Смесь немедленно тщательно перемешивают и помещают на 10-15

минут в водяную баню комнатной

температуры, а затем переносят в кипящую водяную

баню на 15 мнут. По окончании нагревания пробирки быстро охлаждают в проточной

воде и оставляют в теплом месте на 30 минут. Окрашенные растворы колориметрируют на

фотоэлектроколориметре с красным фильтром (620 нм) в кювете толщиной 0,5 см.

Количество глюкозы в испытуемых пробах с гликогеном рассчитывают по стандартной

кривой, которую

строят для каждой серии определений. Для пересчета на содержание

гликогена, полученное количество глюкозы умножают на 0,9 (молекулярная масса

глюкозы в гликогене равна 162,1, глюкозы С

6Н12О6 – 180,1; 162,1:180,1 = 0,8999, или 0,9)

(ГИЛБЕРТ и др., 1967; КОНРАД, 1975).

 Математическое планирование и статистический анализ

При изучении влияния факторов на рост и биосинтез каротиноидов дрожжей

каждый опыт проводился в 3-х повторностях и 3-х параллельных определениях. Для

финального результата был проведен статистический анализ результатов (ДОСПЕХОВ,

1985).

Оптимизация питательной среды для культивирования дрожжей была проведена в

соответствии с математической матрицей планирования эксперимента (МАКСИМОВ,

1980).

ГЛАВА 3

СКРИНИНГ ДРОЖЖЕЙ, ОБЛАДАЮЩИХ ПОВЫШЕННОЙ

СПОСОБНОСТЬЮ К БИОСИНТЕЗУ КАРОТИНОИДНЫХ

ПИГМЕНТОВ

Разнообразие каротиноидных пигментов, обладающих физиологическим и

терапевтическим эффектом, имеющих широкую область применения, объясняет

важность работ по селекции активных продуцентов. Анализ научной литературы позволил

сделать вывод, что дрожжи являются потенциальными источниками, обладающими

высокой способностью к синтезу каротиноидных пигментов (КОЛЬЦОВА, 1984;

ДЕНИСОВ, 2000). Из ряда гемотрофных микроорганизмов, как продуцентов

каротиноидов, можно выделить дрожжи рода Rhodotorula, Cryptococcus, Rhodosporidium,

Phaffia, Sporobolomyces (GOODWIN, 1980; CERDA-OLMEDO, 1989; ФЕОФИЛОВА, 1994;

АВЧИЕВА, 2000).

Практически все каротиноиды представляют собой или тетратерпены, т.е. С

соединения, углеродный скелет которых построен из восьми С

-изопреновых фрагментов,

или их производные. Основная структура молекулы симметрична и состоит из двух С

половин, примером такого соединения может служить ликопин – красный пигмент

томатов. Основная структура иногда бывает модифицирована: на одном или обоих концах

молекулы может присутствовать шестичленное (или иногда пятичленное) кольцо, как

например у β-каротина, который рассматривается как «прародитель» для всей группы

каротиноидов (Каротинсинтезирующие.., 1980; БЕРРИ,1985; BRITTON, 1990).

Каротиноидные углеводороды известны под названием каротинов. Все их

производные с кислородсодержащими функциональными группами именуются

ксантофиллами. В каротиноидах обнаруживается большинство обычных групп,

например, гидрокси-, метокси-, эпокси-, кето-, альдегидная и карбоксильная группы; при

этом соответствующие группы могут быть этерифицированны или гликолизированы. У

микроорганизмов каротиноиды сопровождаются, обычно, бесцветными алифатическими

полиенами - фитоином и фитофлюином (ANHILD et. al., 1995; КИРИЛЛОВА и др.,1996).

За последние десять лет, благодаря интенсивному и комплексному использованию

новейших методов исследования (газожидкостная хроматография, спектроскопия

поглощения видимого света, количественный анализ, спектрофотометрический анализ,

рамановская спектроскопия, линейный и круговой дихроизм), наблюдается значительный

прогресс в химии каротиноидов, судить о котором можно по следующему примеру: в

1946 г. было известно около 70 каротиноидов, из которых для 30-40 была установлена

определенная структура, а в настоящее время число известных нам каротиноидов