Кирица Е. Направленный синтез каротиноидов у дрожжей и перспектива их использования
Подождите немного. Документ загружается.
АКАДЕМИЯ НАУК МОЛДОВЫ
ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ
На правах рукописи
УДК 579.695+579.66’112.3+663.14
КИРИЦА ЕЛЕНА
НАПРАВЛЕННЫЙ СИНТЕЗ КАРОТИНОИДОВ У
ДРОЖЖЕЙ И ПЕРСПЕКТИВА ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ
03.00.23 - БИОТЕХНОЛОГИЯ
Диссертация на соискание
ученой степени доктора биологии
Научный руководитель:
Усатый А. С.,
Доктор хабилитат биологии,
конф. исследователь
Автор:
Кирица Елена
Кишинев
2005
2
СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ …………………………………………………………………………….….4
1. КАРОТИНОИДНЫЕ ПИГМЕНТЫ – БИОЛОГИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ
И ПЕРСПЕКТИВА ИСПОЛЬЗОВАНИЯ…………………………...…8
1.1. Микроорганизмы – потенциальные источники каротиноидных пигментов….….…..8
1.2. Химическое строение и биосинтез каротиноидных пигментов …………………..…11
1.3. Биологические функции и область применения каротиноидов…………………..….18
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ……………….……………….……….……..25
2.1. Предмет исследований ……………………………………………………………....…25
2.2. Питательные среды для культивирования каротинсинтезирующих дрожжей.…..…25
2.3. Биостимуляторы, индукторы и координационные соединения металлов ……..……26
2.4. Аппаратура и оборудование……………………………………………………….….…26
2.5. Реактивы……………………………………………………………………………..……26
2.6. Методы исследований……………………………………………………..………..….…27
ГЛАВА 3. СКРИНИНГ ДРОЖЖЕЙ, ОБЛАДАЮЩИХ ПОВЫШЕННОЙ
СПОСОБНОСТЬЮ К БИОСИНТЕЗУ КАРОТИНОИДНЫХ
ПИГМЕНТОВ .…………………………………………………………….…30
3.1. Продуктивность и содержание общего количества каротиноидов в биомассе
дрожжей рода Rhodotorula………………………………………………….…..…....….31
3.2. Качественный состав каротиноидных пигментов дрожжей
рода Rhodotorula………………………………………………………………..……..….34
ГЛАВА 4. ВЛИЯНИЕ НЕТРАДИЦИОННЫХ ИСТОЧНИКОВ
ПИТАНИЯ, ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ, ИНДУКТОРОВ И
МЕТАЛЛОКОМПЛЕКСОВ НА ПРОДУКТИВНОСТЬ И
БИОСИНТЕЗ КАРОТИНОИДОВ У ДРОЖЖЕЙ ………………….….….40
.
4.1. Влияние нетрадиционных источников питания на продуктивность
и биосинтез каротиноидов дрожжами Rhodotorula gracilis CNMN – YS-03….……..42
3
4.2. Влияние предшественников на продуктивность и биосинтез каротиноидов
дрожжами Rhodotorula gracilis CNMN – YS-03………………………………………..46
4.3. Влияние индукторов на продуктивность и биосинтез каротиноидов
дрожжами Rhodotorula gracilis CNMN-YS-03…………………………………...….…51
4.4. Влияние координационных соединений Fe (II) на биосинтез каротиноидов
дрожжами рода Rhodotorula……………………………………………………….…….57
4.5. Способы направленного синтеза каротиноидов у дрожжей………………….…...…..64
ГЛАВА 5. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДРОЖЖЕВОЙ БИОМАССЫ С
ПОВЫШЕННЫМ СОДЕРЖАНИЕМ ЦИНКА………………………………....77
.
5.1. Продуктивность и биосинтез каротиноидных пигментов дрожжами,
культивируемыми в присутствии различных соединений цинка………………….…78
5.2.Оптимизация среды и разработка способа получения цинксодержащей биомассы..85
ГЛАВА 6. БИОТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ НОВЫХ ПРЕПАРАТОВ НА
ОСНОВЕ КАРОТИНСИНТЕЗИРУЮЩИХ ДРОЖЕЙ РОДА RHODOTORULA….93
6.1. Технология получения препарата из пигментных дрожжей для
стимулирования жизнеспособности икры и личинок рыб……………...………..….…93
6.2. Технология получения
цинксодержащей биомассы пигментных
дрожжей, предназначенной для стартовых кормов личинок рыб………………..…101
ЗАКЛЮЧЕНИЕ …………………………………………………………………….….…..106
ВЫВОДЫ…………………………………………………………………………….….…..110
БИБЛИОГРАФИЯ……………………………………………………………………....…112
РЕЗЮМЕ……………………………………………………………………………….……127
4
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы
Поиск биологически активных соединений, синтезируемых микроорганизмами в
настоящее время остается весьма актуальной задачей современной биотехнологии. Это
обусловлено возможностью получения путем микробного синтеза различных продуктов,
богатых витаминами, липидами, белками, микроэлементами и другими биологически
активными веществами (ФЕОФИЛОВА, 1994; CANIZARES-VILLANUEVA, 1998;
ЛЕЩИНСКАЯ, 2000).
Из продуктов микробного синтеза особый интерес представляют – каротиноиды,
являющиеся наиболее многочисленной и распространенной группой природных
пигментов (BRAMLEY et. al., 1992; YOUNG et. al., 2001). С каждым годом потребность в
каротиноидах возрастает, что требует расширения потенциальных источников их
получения. В настоящее время каротиноиды можно получить путем химического синтеза,
микробиологическим способом или выделением из растительного сырья (SANDU, GOSHI,
1997; RUDIC, BULIMAGA, 2003).
В связи с тем, что дрожжи способны синтезировать широкий спектр каротиноидов,
а также обладают способностью в процессе ферментации накапливать достаточное
количество биомассы и расти на относительно дешевых средах, эта группа эукариотных
микроорганизмов может занять прочные позиции в современной биотехнологии, в том
числе и в области микробиологического синтеза каротиноидов (BEN-AMOTZ, 1999;
SANDMAN, 2001). Это, в свою очередь, способствует более интенсивному изучению
направленного синтеза каротиноидных пигментов.
Каротиноидные пигменты, находящиеся в
микробной клетке, обладают высокой
биологической активностью. Около 10% каротиноидов (альфа-, бета-, гамма- и
дельтакаротин) являются предшественниками витамина А (ретинола). Помимо
провитаминного действия, каротиноиды нашли применение для профилактики и лечения
многих заболеваний: каротин обладает радиопротекторными свойствами, усиливает
лечебное действие некоторых противоопухолевых препаратов (ХИГГИНС, 1988;
BABIEVA, 1991; БУКИН, 1997; BLACK, 1998). Во многих странах каротиноидные
пигменты используются в качестве
пищевой добавки к хлебу, маслу, к маргарину и
многим другим пищевым продуктам (www.uralbiopharm.ru). Используются каротиноиды
и для изготовления косметических средств, а также в качестве добавки в корм для рыб.
(CADAR, 1990; YAMADA et. al., 1990; www.uniagro.ru; www.vitamarket.ru;).
Развитие современных биотехнологий по получению новых форм каротиноидных
препаратов высокого качества и их применение в качестве физиологически активных
5
веществ могут способствовать решению многих задач по повышению продуктивности
сельскохозяйственных животных, птиц, рыбного хозяйства в Молдове. Их адекватность
уже была доказана в различных странах, таких как Румыния, Россия, Украина, Япония
(www. Vitamarket.com.ua. www.uralbiopharm.ru; ФЕОФИЛОВА, 2001).
Очевидна целесообразность поиска высокопродуктивных штаммов, разработки
высокопродуктивной биотехнологии по культивированию пигментных дрожжей,
оптимизации питательных сред и способов получения каротиноидов, а также расширение
списка экологически чистых препаратов для нужд республики.
Цель исследований: изучить особенности каротиногенеза у дрожжей под
влиянием различных факторов, разработать способы направленного синтеза каротиноидов
и биотехнологии получения новых препаратов на базе дрожжевых каротиноидов.
Задачи:
Изучить комплекс каротиноидных пигментов у дрожжей и отобрать штаммы,
обладающие повышенной способностью к каротинообразованию.
Исследовать особенности процесса биосинтеза каротиноидов дрожжами под
влиянием нетрадиционных источников питания, предшественников,
индукторов и координационных соединений некоторых переходных металлов.
Разработать способы направленного синтеза каротиноидов у дрожжей.
Разработать способ получения биомассы дрожжей с прогнозируемым
содержанием цинка.
Разработать биотехнологии получения новых препаратов на базе
каротинсинтезирующих дрожжей рода Rhodotorula.
Научная новизна
Получены новые данные о качественном и количественном составе каротиноидов
дрожжей рода Rhodotorula. Отобраны штаммы, представляющие интерес как
потенциальные источники каротиноидов.
Выявлены особенности синтеза каротиноидных пигментов дрожжами рода
Rhodotorula, культивируемых на питательных средах с нетрадиционными источниками
питания: экстрактом виноградного, яблочного и томатного шротов, предшественниками
(подсолнечное, оливковое, кукурузное, соевое масла и ретинол), индукторами (ацетат
натрия, ацетат цинка и лимонная кислота) и координационными соединениями некоторых
переходных металлов ([Fe
2NiO(CCl3COO)6(CH3OH)3] и [Fe
2
Mn(CCl
3
COO)
6
(CH
3
OH)
3
]).
6
Впервые установлена эффективность использования координационных соединений
Fe (II), в качестве биорегуляторов процесса каротиногенеза (Brevet de invenţie MD 2282).
Используя методы математического планирования экспериментов, разработаны и
оптимизированы составы питательных сред для культивирования дрожжей, в
соответствии с конечной целью - увеличение общего содержания каротиноидов или
получение его отдельных компонентов. Разработан способ получения биомассы с
прогнозируемым содержанием цинка.
На базе пигментных дрожжей разработаны технологии получения новых препаратов
для стимуляции жизнестойкости икры рыб и для использования в составе стартового
корма для личинок рыб (Brevet de invenţie MD 2593, 2004.11.30; Hotărâre pozitivă nr. 4587
din 19.10.2005).
Теоретическая и практическая значимость работы
Проведенные исследования открывают новые пути применения результатов в
решении проблемы, связанной с регуляцией биосинтетических процессов при
культивировании пигментных дрожжей рода Rhodotorula и повышения количественного
содержания каротиноидных пигментов.
На основе экспериментальных результатов предлагаются варианты питательных
сред, способствующих эффективному биосинтезу каротиноидов. Предлагается
использование [Fe2NiO(CCl3COO)6(CH3OH)3] в качестве биостимулятора процесса
каротинообразования у дрожжей. Предлагается новый способ получения биомассы
дрожжей с прогнозируемым содержанием цинка.
Технологии получения биопрепаратов на основе дрожжей рода Rhodotorula
открывают новые перспективы их использования в аквакультуре, в особенности для
стимуляции икры и использования в составе стартового корма для личинок рыб.
Апробация результатов
Основные результаты были сообщены на различных встречах, конференциях и
симпозиумах.
The Second International Conference on ecological Chemistry (October, 11-1,2002,
Chişinău, Republic of Moldova); 5
th
International Symposium on “Metal Elements in
Environment, Medicine and Biology”, Timişoara, România, November 4-6, 2002;
Simpozionul al II-lea Naţional cu participare internaţională «Inginerie genetică şi botehnologii
moderne», 24-25 octombrie 2002, Chişinău; Salonul internaţional «Ecoinvent - 2003»
“Tehnologii, Instalaţii şi Aparate utilizate în protecţia mediului”, 19-22 iunie 2003, Iaşi,
7
România, Catalog (medalia de bronz); Expoziţia Naţională Specializată “Infoinvent 2003”,
octombrie, Chişinău 2003, (medalia de bronz); Conferinţa ştiinţifică “Bazele conceptuale ale
dezvoltării durabile a Republicii Moldova”, Sesiunea Ştiinţifică “Tehnologii moderne în
agricultură şi protecţia mediului înconjurator”, 25-27 noiembrie 2003, Chişinău, 2003; 53
rd
World exhibition of innovation, research and new technology “BRUSSELS EUREKA 2004”,
16/11/2004-21/11/2004.
Публикации
На основе полученных результатов были опубликованы 24 (4 за личным
авторством) работы, в том числе 3 патента.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из: введения; обзора литературы; методов исследования;
результатов исследований и их описания представленных в четырех главах; выводах.
Библиографические источники включают 187 источника; резюме на румынском, русском
и английском языках. Диссертация представлена на 129 страницах. Иллюстрационный
материал включает 21 таблицу, 27 рисунков.
Ключевые слова: дрожжи, биомасса, каротиноиды, β-каротин, торулин,
торулародин, питательные среды, координационные соединения, экстракты
растительных шротов, индукторы, предшественники.
8
ГЛАВА 1
КАРОТИНОИДНЫЕ ПИГМЕНТЫ: БИОЛОГИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ И
ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ
1.1. Микроорганизмы – потенциальные источники каротиноидных
пигментов
Впервые выделенные еще в начале XIX века из желтой репы и моркови,
каротиноиды, как оказалось, присутствуют в клетках и тканях у представителей всех пяти
царств живой природы от низших бактерий до позвоночных животных. Распространение
и разнообразие каротиноидов в природе обуславливается как способностью организмов к
их биосинтезу, так и способностью их абсорбировать и метаболизировать. Каротиноидные
композиции у различных групп и видов живых организмов не только отличаются по
количественному содержанию, но и различны по качественному составу (BARNET et.al.,
1983; BABIEVA, 1991; ЕРШОВ, 1992).
Следует отметить, что в природе каротиноиды могут находиться в различных
состояниях: в свободном виде они чаще встречаются в пластидах растений, мышечной
ткани рыб, яйцах птиц, в хроматофорах и эпидермальных структурах растений, в форме
каротин-протеинов - в эпидермальных тканях животных и т. д. (GOODWIN,1980;
ФЕОФИЛОВА, 1994; SHANDU, 1997).
Интенсивные методы хозяйствования, получение продуктов длительного хранения, их
глубокая переработка приводят к истощению содержания в них витаминов и
провитаминов, в частности, каротиноидов. Это, вместе с воздействием неблагоприятных
экологических факторов и катастроф, вызывает
их недостаток в организме и, как
следствие, рост заболеваний (RAU, 1988; YOUNG, 2001). Учитывая неоценимую роль
каротиноидов для протекания нормальных физиологических процессов, актуальной
задачей современной биотехнологии является создание новых форм каротиноидных
препаратов высокого качества и их применение в качестве физиологически активных
веществ (RUDIC ş. a., 2001; SANDMAN, 2001).
Среди микроорганизмов, способностью синтезировать каротиноиды, жёлтые,
оранжевые или красные пигменты
(циклические или ациклические изопреноиды)
обладают бактерии, грибы, водоросли и дрожжи (YOKOYAMA, 1985; CERDO-OLDO,
1989; CANIZARES-VILLANUEVA, 1998).
Каротиноиды, найденные у представителей многих классов и семейств
нефотосинтезирующих бактерий, обычно локализованы в клеточных мембранах и в
клеточной стенке. Многие виды растений, бактерий и дрожжей накапливают простые С
40
9
– каротиноиды, такие, как β- каротин, γ-каротин и их производные (CALO-PILVAR, 1995;
ПРИЩЕП, 2000; ЛАДЫГИН, 2001)
Так, характерным каротиноидом галофильных Halobacteria является ациклический
С50 – пигмент бактериорубин. Каротиноиды синтезируют все виды фотосинтезирующих
бактерий, у которых они являются важными компонентами фотосинтетического аппарата.
Среди бактерий, образующих широкий круг каротиноидов, особый интерес представляет
штамм Agrobacterium auranticum, который является продуцентом таких пигментов как
астаксантин, β-каротин, эхиненон, бета-криптоксантин, 3-оксиэхиненон, кантаксантин, 3’-
оксиэхиненон, зеаксантин, адонирубин, адониксантин (YOKOYAMA, 1995). Выделен и
очищен также основной каротиноидный пигмент экстремально радиоустойчивой бактерии
Deinococcus radiodurans (SAITO et. al., 1998). Исследователи предполагают, что этот
каротиноид может обладать высокой антиоксидантной активностью, так как содержит 2
гидроксильные группы, одну карбонильную группу и длинную цепь сопряженных
двойных связей. Пигмент локализован на поверхности клеток и, возможно, действует в
качестве антиоксиданта липидов, белков и полисахаридов на поверхности клетки,
защищая от окислительного стресса, вызываемого ионизирующим и УФ-излучением и,
таким образом, участвуя в повышении радиоустойчивости бактерии (www. stat. bachedu.
ru). Широко известны бактерии рода Micrococcus, содержащие, в основном,
каротиноидные пигменты торулин и торулародин и светочувствительные пигменты
бактериородопсин и меланины (CHATOPODHAY, 1997; emalta1@elstation.agava.ru).
Спектр каротиноидных пигментов, синтезируемых оранжево-красными группами
актиномицетов весьма разнообразен. Способность синтезировать пигменты установлена у
таких видов, как Actinomyces galbus Frommer, Streptomyces chrestomyceticus var.
Ayrantioides. В настоящее время у актиномицетов идентифицированы такие пигменты,
как β- и γ- каротин, ликопин, тетрагидроликопин и проликопин. Количество пигментов,
синтезируемых актиномицетами составляет в среднем 235,6 мкг/г а.с.в. (GLOZEBROOK,
1992
; CANIZARES-VILLANUEVA, 1998).
Очень важным источником получения каротиноидных пигментов могут служить
сине-зеленые водоросли Spirulina platensis (Nordts) CALU – 835, Dunaliella salina Teod.
CALU -834, Spirulina platensis CNM-CB-03, Haematococcus pluvialis, которые являются
натуральными источниками каротиноидов, обладающие способностью к синтезу до 0,44 –
6,9 % β-каротина (РУДИК, 1995; RUDIC şi coaut.,2000; RUDIC şi coaut., 2001, RUDIC şi
coaut., 2003). Большая часть каротиноидов, продуцируемых водорослями приходится на
такие пигменты как β-каротин и астаксантин (FABREGAS et.al., 1988; РУДИК, 1990;
RUDIC şi coaut, 1999; 2001; 2003).
10
Особое место среди продуцентов каротиноидов отводится грибам (ДЕЕВ и др.,
2004). Наиболее перспективными среди них являются представители порядка Mucorales:
Blakeslea trispora, Phycomyces blakesleeanus, Choanephora cucurbitаrum, являющиеся
продуцентами β-каротина и ликопина. Среди грибов в этом отношении представляют
интерес Aspergillus giganteus, некоторые виды Penicillium, Fusarium sporotrichoides,
способный продуцировать до 0,5мг ликопина на грамм сухой биомассы (ГЕССЛЕР и др.,
2002; http://www.biotechknowledge.com). Однако, наиболее высокой каротинообразующей
способностью обладает мукоровый гриб Blakeslea trispora, синтезирующий ликопин до
360 мг/л и β-каротин около 30 мг/100мл культуральной жидкости (ФЕОФИЛОВА, 1994;
MEHTA et. al., 1995; АВЧИЕВА, 1998; ФЕОФИЛОВА, 2004). Известны данные о том, что
исследователи из американской исследовательской службы сельского хозяйства (US
Agricultural Research Service, ARS) создали новые штаммы гриба Fusarium sporotrichoides,
способные синтезировать ликопин и ряд других каротиноидов растительного
происхождения. Специалисты считают, что у массового производства этого пигмента
имеются широчайшие перспективы, особенно если использовать в качестве субстратов
для развития гриба разнообразные побочные продукты растительного происхождения.
Предварительные испытания показали, что грибы способны продуцировать до 0,5 мг
ликопина на 1,0 г сухой биомассы в течение 6 дней при лабораторном культивировании
(АВЧИЕВА, 2001). Один из наиболее доступных продуктов для выращивания грибов -
отходы этанольного производства, состоящие, в основном, из волокнистой части стеблей
зерновых культур (BRAMLEY et. al., 1992;; http://www.biotechknowledge.com).
Другой распространенной группой микроорганизмов, способных к синтезу
каротиноидов, являются красные дрожжи. Некоторые представители дрожжей
(Sporobolomyces, Phaffia, Rhodosposporidium, Cryptococcus, Sporidiobolus, Sterigmatomyces)
способны синтезировать широкий спектр каротиноидов, количество которых может быть
более 10 (ликопин,- α-, β- и γ- каротин, неуроспорен, фитоен, фитофлуен, лютеин,
ликофил, ликоксантин, рубиксантин, криптоксантин, зеаксантин, виолаксантин,
родоксантин, астаксантин, флавоксантин) (SCHRAEDER, 1995). Наиболее часто среди них
выделяются такие пигменты, как β-, γ- каротины, торулин, торулародин и ликопин
(TAMAŞ şi coaut., 1986; КВАСНИКОВ, 1980; Патент RU 2103351, 27.01.98; ЗАЙЧЕНКО
и др., 2000). Среди пигментных дрожжей, как источников каротиноидных пигментов,
следует отметить штамм Rhodotorula glutinis ВКПМ V-2210, который на питательной
среде, включающей источники углерода, азота и минеральные соли, в глубинных
условиях образует биомассу, содержащую 1450-1500 мкг/г каротиноидов (Патент RU
2103351, 27.01.98; www.SIBPATENT.ru). Дрожжи Phaffia rhodozyma обладают двумя